生化仪器分析

1、生化仪器分析课程论文姓 名： 赵燕肖 学 号： 201431511007 学 院： 化工学院 系(专业)： S1466 生物工程 题 目： 蛋白质印迹在检测中的应用进展 指导者： 郑辉杰 2015 年 6 月 15 日蛋白质印迹在检测中的应用进展（赵燕肖 河北工业大学 300000）摘要：随着蛋白质组学研究的日益进展，蛋白质的分离、富集及快速检测等问题受到了极大的关注。目前分子印迹是一种成熟的小分子化合物的分离分析方法，合成的分子印迹聚合物具有三大特征：结构预定性、特异识别性及广泛适用性。随着蛋白质组学研究的不断深入，近年来分子印迹技术在蛋白质组学研究中也取得了一定的进展，其主要着力于蛋白质的

2、纯化、分离和富集。本文主要介绍了蛋白质印迹的特点、原理、应用及其意义。关键词：蛋白质 分子印迹 原理 应用 Abstract: With the growing progress of proteomics research , problems such as protein separation , enrichment and rapid detection of received great attention .  The current molecular imprinting is a mature analysis method, the separation of

3、small molecular compound synthesis of molecularly imprinted polymer has three characteristics: reserve structure, specific recognition and extensive applicability. With the deepening of the proteomics research, in recent years, molecular imprinting technology in proteomics research has also made cer

4、tain progress, its main focus on protein purification, separation and enrichment. This article mainly introduced the characteristics, principle, application and significance of protein imprinting.Key word: protein molecular imprinting principle application自20世纪70年代以来，分子印迹技术迅速发展，因其存在巨大的潜在应用价值，受到广泛的关注

5、，成为材料学、分析化学、生物化学和生物医药等领域研究的前沿。在过去20年中，对分子印迹材料的研究层出不穷，印迹的模板分子包括糖类、甾体、杀虫剂、药物分子和氨基酸衍生物等，其应用领域涉及色谱填料、固相萃取、给药系统、催化和生物传感器等1。分子印迹技术 (molecular imprinting technique, MIT) 其原理是模拟自然界中的抗体 抗原的反应机理，是指制备对模板分子具有特异性识别作用的聚合物的技术，由于其具有结构预定性、特异识别性和广泛实用性三大特点，MIT 被认为是一种前景很好的分离技术。利用分子印迹技术可以制备出与模板分子在空间结构上相匹配的分子印迹聚合物(molecu

6、lar imprinting polymers, MIPs)。MIPs 拥有稳定性好、选择性高、抗恶劣环境强、亲合力强等优点，因此分子印迹聚合物在固相萃取、模拟抗体、药物释放等方面有广泛的应用2。然而，到目前为止，大多数成功的印迹集中在结构简单的小分子上面，而印迹大分子如蛋白质则较少获得成功。印迹这些大分子面临的主要困难是：大分子的体积大、结构复杂、可溶性、易失活等。下面综述了蛋白质的基本性质、蛋白质印迹的研究意义、蛋白质分子印迹的原理、制备方法、应用、存在的问题与展望。1蛋白质印迹的特点及难点目前蛋白质印迹在分子印迹领域的所占的比例比较小，仍处于探索阶段，因此有必要对蛋白质印迹技术进行深入地

7、研究，由于蛋白质自身的特点，目前蛋白质印迹还存在以下难点：(1)蛋白质体积庞大：作为一种典型的生物大分子，蛋白质体积庞大，分子量达到上万甚至更多。以蛋白质为模板分子时，由于体积庞大，使其难以接近或者离开形成的键合位点，导致模板蛋白包埋在内，难以洗脱，同时也会增大传质阻力。最终导致合成的蛋白质印迹聚合物选择性差。(2)蛋白质结构复杂：蛋白质表面积大，其表面上含有大量可与功能单体发生作用的功能基团，因此对蛋白质印迹吸附时，很容易发生非特异性吸附，最终严重影响印迹聚合物的选择性变差。(3)蛋白质构象灵活：蛋白质容易受到外界环境（pH、盐、热等）的刺激而发生构象变化甚至引起变性。当蛋白质的构象发生改变

8、时，对已发生构象变化的蛋白质进行印迹，得到的印迹聚合物对真正的模板蛋白可能不能进行识别。因此蛋白质灵活的构象会影响印迹聚合物的选择性。(4)蛋白质的水溶性：蛋白质大多溶于水溶液中，不能溶于有机溶剂，会引起蛋白质变性。一般的小分子印迹都是在有机溶剂中进行的，其中氢键是主要的识别作用力。但是蛋白质不能溶于有机溶剂，这就大大限制了溶剂的选择。因为蛋白质印迹过程主要在水溶液中进行。但在水溶液中，模板蛋白与功能单体之间的氢键作用会受到水的破坏，因此，在蛋白质印迹中急需寻找到合适的水溶性的功能单体和交联剂。2蛋白质印迹技术的原理2.1制备步骤蛋白质分子印迹聚合物的制备通常经过以下三个步骤3：(1) 功能单

9、体与模板分子的功能基团之间在适当的条件下通过共价键或非共价键作用结合，形成复合物；(2) 加入交联剂，在引发剂的作用下，在模板分子 功能单体复合物周围发生聚合反应，形成聚合物；(3) 用一定的方法将模板分子从聚合物中除去，得到与模板分子在空间结构上相匹配、可特异性识别模板分子的三维空穴。2.2蛋白质印迹分类根据模板分子与功能单体之间作用力性质的不同，蛋白质印迹主要分为共价印迹、非共价印迹和半共价印迹：(1) 共价印迹是指模板分子与功能单体以共价作用形成复合物，如形成硼酸酯、席夫碱等4。聚合反应结束后，将模板分子从聚合物中除去比较困难，因为要除去模板分子，必须使共价键断裂，但是共价键的断裂需要很

10、大的能量，通常在酸或碱性条件下除去模板分子，这容易使蛋白质失活。但此法合成的印迹聚合物拥有高亲和力和高选择性，是由于其功能基团的空间精确排列、结合位点的形状。(2) 非共价印迹5是指模板分与功能单体通过非共价键作用（如氢键、静电力、疏水作用、偶极力、金属螯合、范德华力离子作用等）形成多重作用位点。该法印迹过程简单，并可以在温和的条件下除去模板分子，印迹聚合物的分子识别过程更接近天然的识别系统。但印迹聚合物选择性较低，且专一性不强。(3) 半共价印迹6是指模板分子与功能单体先通过共价键作用形成预聚物，聚合反应后以水解等方法破坏共价键，除去模板分子，然后聚合物再结合模板分子时则以非共价键相互作用。

11、该法兼具了共价印迹法的高亲和性和高选择性及非印迹法反应条件温和等优点。3蛋白质印迹技术的应用近年来，蛋白质分子印迹技术在蛋白质的分离提纯7、模拟抗体8、生物传感器9等方面有广泛的应用。3.1分离提纯分子印迹聚合物对模板分子具有特异性识别，利用分子印迹技术制备的蛋白质分子印迹聚合物对模板蛋白具有良好的特异识别性和较高的选择性，这在生命科学和医学分析中尤为重要。例如在胆红素和许多酶的测定中，血红蛋白对目标物质的测定有干扰作用，而利用血红蛋白的 MIP 可在不同溶液中可除去血红蛋白。孙瑞丰等10通过本体聚合得到了人血红蛋白的 MIP，并作为液相色谱仪的固定相，对印迹蛋白质进行色谱分离；3.2模拟抗体

12、蛋白质 MIP 有类似于抗体或者受体的高度特异识别性，因此使用分子印迹技术制备的模拟抗体可以代替天然抗体在放射免疫分析和酶联免疫分析中的应用。而且与天然抗体相比，蛋白质 MIP 具有物理化学性能稳定、易制备、可重复利用等优点。Hoshino 等11首次采用分子印记技术，人工合成了蜂毒素的抗体(塑料抗体)，并在活老鼠身上进行了试验，研究发现，合成的蜂毒素抗体能够大大提高被注射了蜂毒素的老鼠的存活率，就像天然抗体一样。3.3生物传感器分子印迹生物传感器是由具有高度特异识别性的蛋白质 MIP 为识别部分和转换部分组成，MIP 对目标蛋白产生的响应通过转换器输出信号。和传统的传感器相比，以蛋白质制成的

13、传感器能保持较好的选择性和灵敏性，识别性能不会受到酸、碱、有机溶剂等的影响，而且其制作成本低、耐受性高、寿命长等。李学成等12以邻苯二胺和对苯二酚为功能单体，心肌肌钙蛋白 I（cTnI）为模板分子，利用循环伏安法在玻碳电极表面聚合形成了分子印迹膜。该分子印迹传感器具有制备简单、特异性及稳定性好等优点。4蛋白质印迹研究的意义人类基因组计划在生命科学界得到广泛地实施和推进，目前生命科学研究已经进入了后基因组时代，主要的研究对象包括结构基因组和蛋白质组学等研究的功能基因组学。其中，蛋白质组是指一个基因组或一个细胞、组织表达的所有蛋白质。蛋白质组学是在蛋白质水平上定量、动态、整体性地研究生物体。其主要

14、研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达、翻译、修饰、构象及蛋白质间相互作用等。蛋白质组学的研究是探索生命奥秘的必须，也能为了人类的健康事业作出贡献。随着蛋白质组学研究的日益进展，蛋白质的分离、富集及快速检测等问题受到了极大的关注。目前分子印迹是一种成熟的分离方法，合成的分子印迹聚合物具有三大特征：结构预定性、特异识别性及广泛适用性。近年来蛋白质印迹技术在蛋白质组学研究中取得了一定的进展。蛋白质印迹技术是一种以蛋白质分子为模板分子进行印迹，合成出具有特异性识别和高吸附量的蛋白质印迹聚合物的技术，可应用于蛋白质组学中蛋白质的纯化、分离和富集。蛋白质印迹聚合物可应用于蛋白质组学中高丰度蛋白的去除和低丰度

15、蛋白质的富集。同时蛋白质印迹聚合物具有特异性识别能力，因此可将其应用于模拟抗体、药物传输、生物传感器等生物医学领域。随着蛋白质印迹技术的不断发展，必将加速对蛋白质组学的研究，进而为人类的健康事业做出更大的贡献。5问题与展望近年来，由于分子印迹聚合物的结构预定性、特异性识别和广泛的实用性三大特点，分子印迹技术得到了飞速地发展，尤其是在有机和无机小分子的印迹研究取得了很大进展，但是对于生物大分子如蛋白质印迹技术还处于摸索阶段，按照常规方法对蛋白质印迹还比较困难，因此有必要对蛋白质分子印迹进行进一步的研究。目前蛋白质印迹主要存在的问题有：(1) 目前由于蛋白质 MIP 的识别作用影响因素多，对蛋白质

16、印迹的机理研究相对肤浅，大部分的研究都只停留在蛋白质 MIP 的制备过程和识别过程的表观研究。对于功能单体与蛋白质的作用机理、传质机理、识别机理等仍然不够明确，还需深入研究。(2) 蛋白质分子印迹主要依靠非共价键作用，而在有机溶剂中分子印迹赖以识别的氢键和静电作用得到增强。然而，蛋白质在有机溶剂中容易失去活性，而在水进行印迹则因为水的极性强，导致非共价键作用减弱。对于蛋白质印迹和识别，在水溶液中进行蛋白质印迹具有十分重要的意义。因此寻找合适的水溶性单体和交联剂，利用特殊的分子作用力在水溶液中进行蛋白质印迹和识别是目前蛋白质印迹的一大难题。(3) 目前蛋白质的洗脱剂有：含有SDS的乙酸溶液、含山

17、梨醇的磷酸缓冲液、EDTA和氯化钠溶液、含 Tween 20 的乙酸溶液等13，但是洗脱出来的活性蛋白质一般很难再回收使用，这在一定程度上限制了蛋白质分子印迹的应用。因此寻找温和有效地洗脱蛋白质的方法是一个有待解决的课题。尽管目前蛋白质印迹技术存在以上这些问题，但是随着技术的不断向前发展，蛋白质印迹技术存在的这些难题会逐步得到解决。近年来，我国学者对蛋白质的分子印迹技术已给予极大的关注，并做了许多开创性的工作，深信经过不懈的努力，我国学者会在该领域做出更大的贡献。参考文献：1 孙寅静，罗文卿，潘俊蛋白质分子印迹技术的研究进展及应用前景J药学学报，2011，46(2)：132-1372 Krys

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19、ked poly(acrylamides) and poly(methacrylamides)A new class ofmacroporous polyamidesMacromolecules，1990，23(21)：449745075 Andersson L，Sellergren B，Mosbach KImprinting of amino acid derivatives in macroporous polymersTetrahedron Letters，1984，25(45)：521152146 齐沛沛，王金成，陈吉平选择性分离酚类的半共价分子印迹聚合物及其制备和应用Cn201010176564220117 张卫表面分子印迹技术在蛋白质识别分离中的应用南开大学硕士学位论文天津：南开大学，20098 Piletsky S A，Piletska E V，Bossi A，et alSubstitution of antibodies andreceptors with molecularly imprinted polymers in enzyme linked and fluorescentassaysBiose