磁性纳米粒子生物安全性评价

1、磁性纳米粒子生物安全性评价摘要目的：综合运用纳米、化学等研究领域的先进技术制备磁性纳米粒 了，并采用葡萄糖酸(gla)和低聚壳聚糖(cso)分别对磁性fe304 纳米粒子进行界面修饰，制备出分散性好、生物亲和性高的gla-fe304 和cs0-fc304两种磁性纳米粒子。研究gla-fc304和cs0-fc304两种 磁性纳米粒子在吸附时间、ph值和初始蛋口的浓度的影响因素下对 牛血清白蛋白(bsa)的吸附性能。同时对gla-fe304和cso-fe304 两种磁性纳米粒了的生物相容性进行研究。初步探讨gla-fe3o4和 cso-fe3o4两种磁性纳米粒子在体外与小鼠巨噬细胞raw264.

2、7相互 作用的可能机制。本研究为该类磁性纳米粒子在医药及生物吸附等领 域的应用提供了实验依据。方法:采用化学共沉淀法制备磁性fe304纳米粒子，用葡萄糖酸 (gla)直接接枝到fe304磁性纳米粒子表面，低聚壳聚糖(cso)通过硅 烷偶联剂间接接枝到磁性fe304纳米粒了的表面，制备出gla-fe304 和cs0-fe304两种磁性纳米粒子。利用红外光谱(ft-ir)、热重分析 (tga)检测纳米粒子的组成以及修饰物质在纳米粒子表面的覆盖率，x 射线衍射(xrd)测量其晶体结构，纳米粒度仪测定纳米粒子的表面电 位，扫描电子显微镜(sem)观察磁性纳米粒子的形态。fe304、gla-fe304和

3、cs0-fe304在单因素变量(时间、ph及 初始bsa浓度)的条件下分别与牛血清白蛋白bsa相互作用，通过考 马斯亮蓝法(bradford法)利用紫外分光光度计测定波长在595nm 处上清液中bsa浓度间接计算出磁性纳米粒子吸附bsa的量。三种磁性纳米粒子浓度设定为25-800 ug/nil七个浓度，分 别与小鼠巨噬细胞raw264. 7作用24h、48h和72h后与mtt共孵育 4h利用酶标仪测定570nm处吸光值，计算细胞增值率。不同浓度的 三种磁性纳米粒子与新鲜人血在37°c共孵育60min,利用酶标仪 545nm处测定离心上清液的吸光值，计算溶血率。采用普鲁士蓝铁染色法观察

4、小鼠巨噬细胞raw264. 7摄取的磁性纳米粒子,通过透射电子显微镜更进一步观察粒子进入细胞的方式、分 布及细胞细微结构的变化。结果：制备的磁性纳米粒子粒径为20 nm左右，形状均匀，分散性 好,葡萄糖酸和低聚壳聚糖在磁性fe304纳米粒子表面的接枝率分别 为 20.03%和 15. 40%obsa蛋白吸附实验结果显示：本实验条件下，磁性纳米粒子 与bsa作用60min可达到饱和吸附量，当bsa初始浓度为0. 6mg/ml 时，gla-fe3o4 和 cs0-fe304 吸附 bsa 的量分别为 58. 83mg/g 和 72. 68mg/go当ph小于bsa的等电点时，葡萄糖酸修饰的磁性fe

5、304 纳米粒子吸附bsa的量高于低聚壳聚糖修饰的磁性纳米粒子；当ph 大于bsa的等电点时，低聚壳聚糖修饰的磁性纳米粒子吸附bsa的量 反而高于葡萄糖酸修饰的粒了。mtt实验结果表明24h内gla-fc3o4和cso-fc3o4对小鼠巨 噬细胞raw264. 7均没有毒性。gla-fe3o4和cso-fe3o4溶血实验阴 性。两种纳米粒子均能够被小鼠巨噬细胞raw264. 7摄取，细胞形态 和内部结构未见明显异常。结论:本研究制备出分散性好、生物亲和性高的gla-fe304和 cs0-fe304两种磁性纳米粒子。纳米粒子吸附bsa的行为与多种因素 有关，粒子表面的带电性质和环境的ph尤为重要

6、，bsa等电点两侧 ph环境下gla-fe304和cs0-fe304吸附bsa的量截然不同，这提示 两种纳米粒子与bsa分子间的吸附行为可能与分子间的静电作用力 有关。gla-fc304和cso-fc304对正常细胞未表现出明显的毒性，对 细胞形态及结构没有明显的影响，体外实验条件下未发丰溶血反应, 表明这两种磁性纳米粒子可以安全用于生物和医药等领域。关键词：磁性纳米粒子；表面修饰；牛血清白蛋白；壳聚糖；蛋白 质吸附、八 冃ij s随着人们对纳米材料认识的不断提高，尤其是磁性纳米材料 的问世，纳米技术越来越深入到各个领域。磁性纳米粒子不仅具有普 通的纳米微粒和纳米固体的四个基本的效应，即表面效

7、应、小尺寸效 应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应1,还具有超顺磁性、高矫 顽力和低居里温度等特性2,可以在恒定磁场下聚集和定位、在交 变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒被应用于核磁 共振成像(mri)、药物靶向及控释、肿瘤诊断与治疗等方面。鉴于具有磁性能的纳米材料的广泛应用，促使了其制备方法 也在不断地成熟，到目前为止，人们已经发展了多种方法制备各类纳 米粒子。按制备技术分类，可分为机械粉碎法、气体蒸发法、溶液法、 激光合成法、等离子体合成法、射线辐照合成法、溶胶-凝胶法等； 按照合成的环境可分为液相合成法、气相合成法和固相合成法；按研 究纳米粒子的学科分类，又可将其分为物理方法

8、、化学方法、生物法 和物理化学方法等。早期的物理制备法逐渐被取代，利用较低的成本、 简单易行的技术方法制备岀粒径小、形貌均匀，纯度高，粒度分布窄， 具有良好分散性和磁性，易功能化的纳米粒子是冃前研究的趋势。近十多年里磁性纳米粒子的种类多种多样，多功能的磁性纳 米粒子在生物医学、环境科学和材料科学等众多领域展现出强大的生 命力，尤其在医药领域越来越受到关注。为了将磁性纳米粒子用于生 物医学领域，研究者们采用各种方法制备出不同形貌的磁性纳米粒了, 这些纳米粒子经过表面修饰，在保证磁性的基础上增加了纳米粒的生 物亲和性。多功能磁性粒子现已被应用于磁共振造影剂、肿瘤磁热疗、 磁靶向药物、组织修复利蛋口

9、质固定3-5等方面。对于纳米粒子应 用于疾病诊断治疗对机体可能存在的危害目前也被研究者们重视，同 时要考虑到磁性纳米粒子能否正确及时到达治疗部位，以适当的计量 发挥治疗效果。进入生物体的磁性纳米粒子可能发生团聚、解离和吸 附等变化，受机体防御、清除和免疫反应行为的干扰，因此体外研究 模型可有利的避免这些情况，成为研究纳米粒子细胞毒性和安全性的 平台，为保障纳米科技的安全、健康、可持续发展及安全防护提供科 学依据。目前,许多研究人员报道使用高分子修饰磁性纳米粒子，然而 用有机小分子对磁性纳米粒子改性的报道较少6。葡萄糖酸分子量 小，易溶于水，具有生物亲和性和生物可降解性，曾被应用于固定化 脂肪酶

10、的领域7壳聚糖具有纶物相容性、牛物活性利可降解性8, 但由于壳聚糖分子量大，分子含有大量氢键，因此不溶于水，其应用 受到很大限制。经解聚后的低聚壳聚糖其分了量小，易溶于水，可被 吸收利用，表现出独特的功能和生理活性，如提高巨噬细胞的吞噬能 力，活化增殖人体肠道内的双歧杆菌，抑制肿瘤细胞的生长，降低血 脂,吸附胆固醇等。应用葡萄糖酸和低聚壳聚糖分别修饰的磁性fe304 纳米粒子一方面对外加磁场表现出磁响应性，易于磁场分离，另一方 面修饰后的纳米粒子生物活性和生物亲和性增加。壳聚糖含有游离的 -nh2,可共价键合活性物质9。先前的研究多通过库仑引力将壳聚 糖分子物理吸附到磁性纳米粒子的表面以实现对

11、粒子的修饰，但此方 法制备的壳聚糖-磁性纳米粒子的稳定性较差，与其他生物大分子发 生吸附竞争容易脱落。因此我们以（3-氯丙基）三甲氧基硅烷为偶联剂, 将低聚壳聚糖分子共价键合到磁性纳米粒子的表面，得到稳定性强的 cs0-fe304纳米粒子。gla-fe304和cs0-fe304这两种纳米粒子具有 良好的磁性、亲水性和半物亲和性，有广泛的应用前景10这些磁性 粒子被研究用于污水处理、蛋白质提纯、药物运输、固定化酶11 等领域。蛋白质的界面吸附行为研究成为考察材料生物相容性的重要 依据，通过磁性纳米粒子与蛋白质相互作用，可帮助了解纳米粒子在 体内的分布和运输，对阐明药物代谢动力学、作用机制、毒副作

12、用及 开发新药等具有重要的意义。因此我们研究了 gla-fc304和 cs0-fe304对牛血清白蛋白的吸附性能，为分别用葡萄糖酸和低聚壳 聚糖修饰的磁性纳米粒子在医药及生物吸附等领域的应用提供实验 依据。运载着抗癌、抗病毒药物的纳米颗粒最为有效的给药途径是静 脉注射，因此溶血试验对评价材料的安全性尤为重要。溶血试验是通 过纳米粒子在体外与红细胞直接接触，测定其破坏溶解红细胞膜释放 的血红蛋白的游离程度，评价纳米粒子是否对红细胞造成溶血以及发 生溶血的程度，以便在纳米粒子制备时对其含量加以限制确保安全。 溶血试验能够敏感地反应待测样品对红细胞的影响，平均溶血率小于 5%时，就认为该样品合格。一

13、般越是毒性大的材料造成溶血的程度 越大，当测试样品有溶血活动时，提示该样品具有细胞毒性。常用的 评定纳米毒性的方法还有四哇盐（mtt）比色法。还可通过体外与细 胞共培养利用光学显微镜和电子显微镜等观察细胞形态及结构，从而 直观观察纳米粒子对细胞的影响。因此，分别经过葡萄糖酸和低聚壳聚糖改性的磁性fe304纳米粒子 在不同影响因素下与牛血清白蛋白作用的可能机理，改性后的纳米粒 了的生物相容性如何，被raw264. 7细胞摄取后在细胞内的分布情况 及细胞形态、结构有何改变，gla-fe304和cs0-fe304这两种纳米粒 子能否安全用于医药领域，本研究对这些问题进行了探究。第一部分 gla-fe

14、304 和 cs0-fe304 对 bsa 吸附性能的研究引言随着人们对磁性纳米材料相关性能的认识和应用要求的不断 提高，磁性纳米材料的制备方法也多种多样。近几年来，磁性纳米材 料的制备不再是只局限在单一磁性纳米粒子的制备，为了提高材料的 性能和弥补纳米粒了的缺陷，制备出具有纳米结构的表面包裹的复合 材料是目前的大趋势。各种磁性纳米复合材料的问世，增强了纳米粒 子的性能，使其在生物医学等领域有着广泛的应用前景。磁性纳米粒 子不仅具有普通的纳米微粒和纳米固体的四个基本的效应，即表面效 应、小尺寸效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应1,还具有超 顺磁性、高矫顽力和低居里温度等特性2,可以在恒定磁场

15、下聚集 和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒 被应用于核磁共振成像(mri)、药物靶向及控释、肿瘤诊断与治疗等 方面。鉴于具有磁性能的纳米材料的广泛应用，促使了其制备方法也 在不断地成熟，早期的物理制备法逐渐被取代，利用较低的成本、简 单易行的技术方法制备出粒径小、形貌均匀，纯度高，粒度分布窄, 具有良好分散性和磁性，易功能化的纳米粒子是目前研究的趋势。到目前为止，人们已经发展了多种方法制备各类纳米粒子。 按制备技术分类，可分为机械粉碎法、气体蒸发法、溶液法、激光合 成法、等离子体合成法、射线辐照合成法、溶胶-凝胶法等；按照合 成的环境可分为液相合成法、气相合成法和固相

16、合成法；按研究纳米 粒了的学科分类，又可将其分为物理方法、化学方法、生物法和物理 化学方法等。分类方法不同，研究问题侧重点也不同，根据不同的要 求或不同的粒子范围，可以选择各种适当的方法。当然这些方法有时 可以交叉并用，例如，喷雾法制备纳米粒子的基本操作是物理方法, 但是为了最终获得所需的粒子，还必须进行化学反应。这种情况下, 就需要具体问题具体分析，根据应用所需，选择合适的制备方法，得 到理想的纳米微粒。3总结与讨论由于纳米磁性材料是一种磁性强，制备相对简单，而且是生 物相容性较好的材料，因此在生物医学领域有着广泛的应用。本文综 合了近些年来磁性纳米材料的制备方法及其在生物医学领域中的应 用

17、，详细阐述了磁性纳米微粒和复合微粒的制备方法，从疾病诊断（如 mri成像技术、分了探针）、免疫检测、靶向药物、控释药物、生物 分离、固定化酶、组织修复、基因转染和基因治疗、肿瘤治疗等方面 介绍了磁性纳米材料在生物医学中的应用。目前，关于磁性纳米材料的基本制备方法已近成熟，但仍有 新方法的出现，所以制备方法显得凌乱，也尚未有标准化、规范化的 分类。磁性纳米材料的制备方法与其在生物医学领域中的应用息息相 关，选择的磁性核心粒子不同、磁性微粒表面带电荷性和疏水性的不 同、微粒粒径大小不同等都会影响其在生物庚学应用中发挥的作用。 好的制备方法能够促进磁性纳米材料向实际应用中的发展，当然，也 正是因为在实际领域中的应用需求推动了更多的适应需要的制备方 法的产生。尽管各种制备方法出现参差不齐，但仍需要进行定期归类 总结，在完善的同时做到标准化和规范化。磁性纳米材料在生物医学等领域中的应用