第三章分子荧光光度法

1、第三章第三章 分子荧光光度法分子荧光光度法3-1 3-1 分子荧光概述分子荧光概述分子荧光法的分分子荧光法的分析一般都在溶液析一般都在溶液中进行，如前所中进行，如前所述每个分子都具述每个分子都具有一系列严格的有一系列严格的分立能级分立能级：图中图中S S0 0表示分子表示分子的基态，的基态，S S1 1、S S2 2分分别为第一激发单别为第一激发单重态和第二激发重态和第二激发单重态；单重态；T T为激发为激发三重态；基态和三重态；基态和激发态都存在几激发态都存在几个不同的振动能个不同的振动能级。级。P.82P.82 物质吸收了电磁辐射并发射出荧光的过程中物质吸收了电磁辐射并发射出荧光的过程中大

2、致会经历以下几个过程：大致会经历以下几个过程：1.1.激发：激发： 通常在室温下，大部分分子处于基态的最通常在室温下，大部分分子处于基态的最低振动能级，含有偶数个电子且自旋配对，处低振动能级，含有偶数个电子且自旋配对，处于基态单重态于基态单重态(sinlet state(sinlet state；PauliPauli原理原理) )；当；当其吸收一定频率的电磁辐射其吸收一定频率的电磁辐射( (光量子光量子) )后电子可后电子可发生能级跃迁至第一激发单重态发生能级跃迁至第一激发单重态(S(S1 1) )，这一过程，这一过程称为激发。称为激发。2.2.去活化过程：去活化过程： 处于激发态的分子是不稳

3、定的，可通过几处于激发态的分子是不稳定的，可通过几种不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。种不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。去活化过程主要有以下几种：去活化过程主要有以下几种：(1)(1)振动驰豫：振动驰豫： 溶液中分子之间通过碰撞，受激溶质分子溶液中分子之间通过碰撞，受激溶质分子向溶剂分子转移过剩的向溶剂分子转移过剩的振动能量振动能量，以，以1010-13-131010-11-11秒的速度，通过非辐射跃迁而降至同一电子能秒的速度，通过非辐射跃迁而降至同一电子能级的最低振动能级。这一过程称为振动驰豫。级的最低振动能级。这一过程称为振动驰豫。(2)(2)荧光发射：荧光发射： 处于第一激

4、发单重态最低振动能级的分子，处于第一激发单重态最低振动能级的分子，有几种可能的去活化过程发生，其中之一是以有几种可能的去活化过程发生，其中之一是以1010-9-91010-7-7秒左右的时间内发射光量子回到基态的秒左右的时间内发射光量子回到基态的各振动能级，这一过程称为荧光发射。各振动能级，这一过程称为荧光发射。(3)(3)内转移：内转移： 激发态分子从较高的电子能级转换至较低的激发态分子从较高的电子能级转换至较低的电子能级。电子能级。内转移过程的速度很大程度上决定于内转移过程的速度很大程度上决定于产生此过程所包含的能态之间的相对能量差。产生此过程所包含的能态之间的相对能量差。 当两电子能级非

5、常靠近以至其振动能级有当两电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，内转移就容易发生。重叠时，内转移就容易发生。 如激发单重态如激发单重态S S1 1的高振动能级常与的高振动能级常与S S2 2的低振的低振动能级重叠，两激发态的位能一样，内转移过程动能级重叠，两激发态的位能一样，内转移过程即容易发生，一般需即容易发生，一般需1010-13-131010-11-11秒的时间。秒的时间。(4)(4)体系间的系间窜跃：体系间的系间窜跃： 受激分子从激发单重态转至能量较低的激发受激分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态的过程称为系间窜跃。三重态的过程称为系间窜跃。 如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃

6、如果两个能态的振动能级重叠时，这种跃迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子，迁的几率较大；这些处于激发三重态的分子，继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动继续通过辐射光能而回到基态单重态的各振动能级，所发出的辐射称为磷光。能级，所发出的辐射称为磷光。 由于不同物质的分子结构及分析时所处的由于不同物质的分子结构及分析时所处的化学环境不同，因此各去活化过程的速度也就化学环境不同，因此各去活化过程的速度也就不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程的不同。如果荧光发射过程比其他去活化过程的速度快，就可看到荧光发射现象；相反，则速度快，就可看到荧光发射现象；相反，则看看不到不到荧光，或其强度减弱。荧光，

7、或其强度减弱。 任何荧光化合物都具有两个特征光谱：任何荧光化合物都具有两个特征光谱：激激发光谱发光谱和和发射光谱发射光谱。它们是荧光定性和定量分析。它们是荧光定性和定量分析的基本参数和依据。的基本参数和依据。3-2 3-2 荧光分析法定量依据荧光分析法定量依据一一. .激发光谱激发光谱 以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐以激发光波长为横坐标，荧光强度为纵坐标，标，绘得的谱图称荧光化合物的激发光谱。绘得的谱图称荧光化合物的激发光谱。 绘制激发光谱曲线时，在荧光的最大发射波绘制激发光谱曲线时，在荧光的最大发射波长处，改变激发光波长来测量相应的荧光强度。长处，改变激发光波长来测量相应的荧光强度。

8、激发光谱与吸收光谱不仅形状相同激发光谱与吸收光谱不仅形状相同, ,而且波而且波长位置也一样长位置也一样, ,这是因为物质分子吸收能量的过这是因为物质分子吸收能量的过程就是被激发的过程程就是被激发的过程. .二二. .荧光荧光发射光谱发射光谱 简称荧光光谱或简称荧光光谱或发射光谱发射光谱。如果将激发光波如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，长固定在最大激发波长处，然后扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光发测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光发射光谱。射光谱。下图为萘的激发光谱、荧光发射光谱和下图为萘的激发光谱、荧光发射光谱和磷光发射光谱。磷光发射光谱。激发

9、光谱和荧光发射激发光谱和荧光发射光谱的特点：光谱的特点：(1)(1)荧光发射光谱与激荧光发射光谱与激发波长无关，如前所述，发波长无关，如前所述，无论引起物质激发的波无论引起物质激发的波长是长是 1 1还是还是 2 2，但荧光，但荧光发射波长都为发射波长都为 3 3。 这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基这是由于分子吸收了不同能量的光子可由基态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收态激发到不同的电子激发能级而产生几个吸收带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫带；由于较高激发态可通过内转换及振动弛豫回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能回到第一激发态的几率很高，远远大于由高能级激发态直接发射

10、光子的速度。级激发态直接发射光子的速度。 故在荧光发射时，无论用哪一个波长的光故在荧光发射时，无论用哪一个波长的光辐射来激发，电子都从第一激发态的最低振动辐射来激发，电子都从第一激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发能级返回到基态的各个振动能级，所以荧光发射光谱与激发波长无关，只出现一个荧光谱带。射光谱与激发波长无关，只出现一个荧光谱带。(2)(2)荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系系 将某一荧光物质的荧光光谱和它的吸收光将某一荧光物质的荧光光谱和它的吸收光谱对比时，将发现这两个光谱间呈镜像对称关系。谱对比时，将发现这两个光谱间呈镜像对称关系。 吸

11、收光谱是物质分子的外层电子由基态激吸收光谱是物质分子的外层电子由基态激发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状发至第一电子激发态的各振动能级所致，其形状决定于决定于第一电子激发态第一电子激发态中各振动能级的分布状况；中各振动能级的分布状况； 荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态荧光光谱是激发态分子从第一电子激发态的最低振动能级回到基态中各振动能级所致，的最低振动能级回到基态中各振动能级所致，其形状决定于其形状决定于基态中基态中各振动能级的分布状况；各振动能级的分布状况； 而而第一电子激发态第一电子激发态中各振动能级的分布与中各振动能级的分布与基基态态中各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与中

12、各振动能级的分布相类似，因此荧光光谱与吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。吸收光谱形状相似，并呈镜像对称关系。三荧光和分子结构的关系三荧光和分子结构的关系产生荧光的分子必须具备下列条件：产生荧光的分子必须具备下列条件：( (一一) )物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频物质分子必须具有与所照射的光辐射相同频 率的吸收结构，才能吸收激发光。率的吸收结构，才能吸收激发光。( (二二) )吸收了与其本身特征频率相同的能量之后，吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光效率。必须具有一定的荧光效率。 荧光效率荧光效率也称为也称为荧光量子产率荧光量子产率，表示物质发，表示物质发射荧光的

13、本领，为发出荧光量子数和吸收激发射荧光的本领，为发出荧光量子数和吸收激发光量子数的比值。光量子数的比值。 值一般值一般1 1，如罗丹明，如罗丹明B B的乙醇溶液，的乙醇溶液， =0.97=0.97；蒽乙醇溶液的蒽乙醇溶液的 =0.30=0.30；菲乙醇溶液的；菲乙醇溶液的 =0.10=0.10。 有许多吸光物质不发荧光的有许多吸光物质不发荧光的原因在于激发态原因在于激发态分子释放激发能（去活化）过程中，除荧光发射分子释放激发能（去活化）过程中，除荧光发射以外，还有许多非辐射跃迁与之竞争以外，还有许多非辐射跃迁与之竞争。显然荧光。显然荧光效率与物质结构以及所处的环境密切相关。效率与物质结构以及所

14、处的环境密切相关。什么样的物质会发生荧光什么样的物质会发生荧光? ?实验表明：实验表明：1.1.具有共轭双键结构体系的分子容易发荧光；其具有共轭双键结构体系的分子容易发荧光；其共轭度愈大，共轭度愈大， 电子越易被激发电子越易被激发, ,分子的荧光效率分子的荧光效率也越大，荧光发射光谱向长波长方向移动。也越大，荧光发射光谱向长波长方向移动。2.2.具有刚性平面结构的分子，具有较强的荧光。具有刚性平面结构的分子，具有较强的荧光。这两个物质的荧光效这两个物质的荧光效率分别为率分别为1.01.0和和0.20.2。 这是由于加入了亚甲基使芴的这是由于加入了亚甲基使芴的刚性刚性和和共平面共平面性性增大的缘

15、故。这种结构可减少分子振动，即减增大的缘故。这种结构可减少分子振动，即减少了体系间跨越到三重态和碰撞去活的可能性。少了体系间跨越到三重态和碰撞去活的可能性。3.3.芳环化合物上不同取代基影响该芳环化合物的芳环化合物上不同取代基影响该芳环化合物的 荧光强度和荧光光谱。荧光强度和荧光光谱。给电子基团给电子基团常常使荧光常常使荧光 增强增强，吸电子基团吸电子基团会会减弱减弱甚至甚至破坏荧光破坏荧光；另外；另外 将原子序数大的原子引入到将原子序数大的原子引入到 电子体系中常使电子体系中常使 荧光减弱。荧光减弱。 如：氟苯的荧光效率为如：氟苯的荧光效率为0.160.16，氯苯为，氯苯为0.050.05，

16、溴苯为溴苯为0.010.01，而碘苯则没有荧光。，而碘苯则没有荧光。 取代基之间能形成氢键的，则荧光加强，反取代基之间能形成氢键的，则荧光加强，反之则荧光减弱。之则荧光减弱。 了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮了解荧光和物质分子结构的关系，可以帮助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，助我们考虑如何将非荧光物质转化为荧光物质，或将荧光强度不大或选择性不高的荧光物质转或将荧光强度不大或选择性不高的荧光物质转化为荧光强度大及选择性高的荧光物质以提高化为荧光强度大及选择性高的荧光物质以提高分析的灵敏度。分析的灵敏度。四四. .荧光强度和溶液浓度的关系荧光强度和溶液浓度的关系 按荧光发生机理，可得

17、到溶液的荧光强度按荧光发生机理，可得到溶液的荧光强度和该溶液吸收光的强度和该溶液吸收光的强度I Ia a以及荧光物质的荧光以及荧光物质的荧光效率效率 成正比：成正比： 根据根据BeerBeer定律：定律：A=lg(IA=lg(I0 0/I/It t)=)= bc bc I Ia a=I=I0 0-I-It t=I=I0 0(1-10(1-10- - bcbc) ) aFI代入上式：代入上式： 式中式中I I0 0是激发光强度是激发光强度, , 是摩尔吸光系数是摩尔吸光系数, b, b是是 液层厚度液层厚度, c, c是样品浓度。是样品浓度。2.3030(1) bcFIe又又当当 bc0.05b

18、c0.05时，可略去第二项后的各项。时，可略去第二项后的各项。 e e-2.303-2.303 bcbc =12.303=12.303 bcbc F= F= I I0 0(1(1e e-2.303-2.303 bcbc) ) F= F= I I0 01(12.3031(12.303 bc)=2.303bc)=2.303 I I0 0 bcbc 当激发光当激发光( (入射光入射光) )强度强度I I0 0一定，并且浓度一定，并且浓度c c很小时，荧光强度很小时，荧光强度F F与荧光物质浓度与荧光物质浓度c c成正比。成正比。即：即： F=KF=Kc c232.303( 2.303)( 2.303

19、)1 2.3032!3!bcbcbcebc 上式仅适用于稀溶液，对于较浓的溶液，上式仅适用于稀溶液，对于较浓的溶液，其其 bcbc超过超过0.050.05时，时，F F与与c c的线性关系将发生偏离。的线性关系将发生偏离。 由于浓度过高，使由于浓度过高，使荧光物质分子间荧光物质分子间以及以及荧荧光物质分子同溶剂分子间光物质分子同溶剂分子间的碰撞增加，导致无的碰撞增加，导致无辐射去活增加而发生自熄灭。辐射去活增加而发生自熄灭。 另外在荧光发射波长同化合物的吸收波长另外在荧光发射波长同化合物的吸收波长有重叠的情况下，物质发射出的荧光可能有部有重叠的情况下，物质发射出的荧光可能有部分被自身吸收，造成

20、结果负偏差。分被自身吸收，造成结果负偏差。3-3 3-3 影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 影响荧光强度的因素可归纳为如下几方面影响荧光强度的因素可归纳为如下几方面:一一. .激发光的照射激发光的照射 某些荧光物质的溶液在入射光照射较长时间某些荧光物质的溶液在入射光照射较长时间时，不会发生显著变化；但有些荧光物质的稀时，不会发生显著变化；但有些荧光物质的稀溶液则很容易发生光分解作用而引起荧光强度溶液则很容易发生光分解作用而引起荧光强度急剧降低。急剧降低。 其原因是其原因是某些物质受光照后某些物质受光照后, ,所吸收的能量所吸收的能量使分子内的一个或几个键发生断裂使之分解。使分子内的一个或几

21、个键发生断裂使之分解。如：硫酸奎宁溶液的浓度在如：硫酸奎宁溶液的浓度在1 1 g/mLg/mL以上时，长以上时，长时间经紫外光照射，其时间经紫外光照射，其F F值没有显著变化；但值没有显著变化；但如果溶液的浓度在如果溶液的浓度在0.020.02 g/mLg/mL以下时，以下时，F F值就有值就有显著变化。显著变化。二二. .溶剂溶剂 同一种荧光物质在不同溶剂中，其同一种荧光物质在不同溶剂中，其F F值和荧值和荧光光谱都可能有显著不同。一般荧光峰的波长光光谱都可能有显著不同。一般荧光峰的波长随溶剂介电常数的增大向长波长方向移动，即随溶剂介电常数的增大向长波长方向移动，即 增大。增大。 但也有相反

22、的情况，如苯氨萘磺酸在戊醇、但也有相反的情况，如苯氨萘磺酸在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中丁醇、丙醇、乙醇、甲醇中, ,随极性随极性 ，；且；且荧光光谱的位置与荧光光谱的位置与F F和溶剂极性之间的关系没有和溶剂极性之间的关系没有明显的规律。明显的规律。三三. .温度温度 温度对荧光强度的影响较敏感。一般来说，温度对荧光强度的影响较敏感。一般来说，温度温度 ，荧光强度荧光强度 。如荧光素的乙醇溶液在。如荧光素的乙醇溶液在00以下，每降低以下，每降低1010度，荧光效率约增加度，荧光效率约增加3%3%。 温度增加温度增加，荧光效率下降的主要原因是分荧光效率下降的主要原因是分子内部能量发生变化子内

23、部能量发生变化，溶质与溶剂分子之间的溶质与溶剂分子之间的碰撞机会增大碰撞机会增大，把能量消耗了把能量消耗了。四四. .溶液溶液pHpH值的影响值的影响 如果荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液如果荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液pHpH值的改变对溶液荧光强度将有很大的影响。值的改变对溶液荧光强度将有很大的影响。有些物质在离子状态无荧光，而有些则相反；有些物质在离子状态无荧光，而有些则相反；还有些在离子和分子状态都有荧光，但两者的还有些在离子和分子状态都有荧光，但两者的荧光光谱不一样；等等。荧光光谱不一样；等等。其原因在于它们的分子和离子的电子构型不同。其原因在于它们的分子和离子的电子构型不同。如苯

24、胺在如苯胺在pH=7pH=7 1212的溶液中会发出蓝色荧光，的溶液中会发出蓝色荧光，而在而在pHpH 2 2或或 1313的溶液中，都不发荧光：的溶液中，都不发荧光： 上式表明能发射荧光的是苯胺分子，而苯上式表明能发射荧光的是苯胺分子，而苯胺离子是不发射荧光的。胺离子是不发射荧光的。 金属离子与有机试剂形成的荧光化合物受金属离子与有机试剂形成的荧光化合物受pHpH值的影响更大值的影响更大。pHpH一方面影响配合物的形成一方面影响配合物的形成，另一方面另一方面影响影响配配合物的组成合物的组成。 如镓离子与邻苯二羟基偶氮苯在如镓离子与邻苯二羟基偶氮苯在pH3pH3 4 4的的溶液中形成溶液中形成

25、1:11:1配合物，产生荧光。但在配合物，产生荧光。但在pH6pH6 7 7的溶液中则形成的溶液中则形成1:21:2配配合物，不产生荧光。合物，不产生荧光。3-4 3-4 荧光光度计荧光光度计 荧光分析所用的仪器种类很多，简单的有目荧光分析所用的仪器种类很多，简单的有目测荧光计，光电荧光计等。较精密的有荧光分光测荧光计，光电荧光计等。较精密的有荧光分光光度计；它们的结构、功能和价格差别很大。光度计；它们的结构、功能和价格差别很大。组成荧光光度计的有四大部分：组成荧光光度计的有四大部分：激发光源激发光源、样样品池品池、 测量荧光的测量荧光的检测器检测器及用于选择激发波及用于选择激发波长和荧光波长

26、的长和荧光波长的滤光片或单色器滤光片或单色器。 一一. .光源光源 在紫外可见光区，可供荧光激发用的光源在紫外可见光区，可供荧光激发用的光源很多：钨灯、碘钨灯、氢灯、氘灯、汞灯、氙很多：钨灯、碘钨灯、氢灯、氘灯、汞灯、氙灯等。要求：灯等。要求：光源稳定并具有一定强度光源稳定并具有一定强度。稳定。稳定与否直接影响测量的重复性和精确度与否直接影响测量的重复性和精确度；而强度；而强度则影响测定的灵敏度。则影响测定的灵敏度。二二. .样品池样品池 样品池必须用低荧光的材料制成，通常采样品池必须用低荧光的材料制成，通常采用石英，形状为方形或长方形。用石英，形状为方形或长方形。三三. .单色器单色器 一般

27、采用光栅作单色器，第一激发单色器用一般采用光栅作单色器，第一激发单色器用于选择激发波长；第二发射单色器用于分离出荧于选择激发波长；第二发射单色器用于分离出荧光发射波长。光发射波长。四四. .检测器检测器 荧光的强度通常较弱，因此要求检测器具有荧光的强度通常较弱，因此要求检测器具有较高的灵敏度。一般由光电管和光电倍增管作检较高的灵敏度。一般由光电管和光电倍增管作检测器，检测方向与激发光成直角。测器，检测方向与激发光成直角。由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波由光源发射的光经激发单色器得到所需的激发波长长I I0 0，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收，经样品池后，一部分光能被荧光物质吸收

28、，透光强度为透光强度为I I；荧光物质被激发后，发射荧光；荧光物质被激发后，发射荧光F F。为消除入射光的影响，为消除入射光的影响，荧光测量通常在与激发光荧光测量通常在与激发光成直角的方向上进行成直角的方向上进行。第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的第二发射单色器的设置是为了消除可能共存的其它光线的干扰，如其它光线的干扰，如散射光散射光以及溶液中其它杂以及溶液中其它杂质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其质所发生的荧光，以获得所需要的荧光，让其作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大作用于检测器上，得到相应的电信号，经放大后作记录。后作记录。3-5 3-5 分子荧光光度法的特点及应用分子

29、荧光光度法的特点及应用一一. .荧光光度法的特点荧光光度法的特点1.1.灵敏度灵敏度 与紫外与紫外可见光度法比较，荧光法检测是在可见光度法比较，荧光法检测是在 黑背景下进行，所以其灵敏度要高出黑背景下进行，所以其灵敏度要高出2 2 4 4个个 数量级，测定下限为数量级，测定下限为0.10.1 0.0010.001 g/mLg/mL。2.2.选择性强选择性强 荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收荧光法既能依据特征发射又能依据特征吸收 来检定物质。如某几个物质的发射光谱相来检定物质。如某几个物质的发射光谱相 似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果似，则可从激发光谱的差异来区分；而如果 它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将它们的激发光谱相同，则可通过发射光谱将 其区分。其区分。3.3.试样量少，方法简便试样量少，方法简便 因灵敏度较高，所以试样用量较少，如采用微因灵敏度较高，所以试样用量较少，如采用微 量池测定，用量仅为量池测定，用量仅为1010 L L。4.4.提供较多的物理参数提供较多的物理参数 该方法能提供