姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡作用和机制探究

1、姜黄素诱导结肠癌lovo细胞凋亡作用和机制探究摘要目的：探讨姜黄素促人结肠癌lovo细胞 凋亡的生物学作用及其调控机制。方法：体外培养人结肠癌 lovo细胞，020mgl-1不同浓度姜黄素处理后，采用mtt 比色法测定姜黄素对细胞的增殖抑制作用，利用透射电镜观 察细胞的超微结构，采用pi单标流式细胞仪测定细胞周期 分布，annexin v-fitc/pi双标法检测细胞凋亡率；采用 rt-pcr 检测 bax, bcl-2, caspase-3, bcl-xl mrna 表达水 平。结果：mtt检测显示姜黄素能显著抑制人结肠癌lovo细 胞的生长、增殖，呈现浓度和时间效应关系；透射电镜结果 显示

2、姜黄素能使lovo细胞发生形态学改变，呈现典型凋亡 细胞特征；流式细胞仪分析显示姜黄素能阻滞细胞周期于s 期，诱导细胞发生凋亡。rt-pcr检测显示姜黄素可促进细胞 中 bax, caspase-3 mrna 表达，抑制 bcl-2, bcl-xl mrna 表 达。结论：姜黄素能显著抑制人结肠癌lovo细胞的增殖并 促进其凋亡，这种生物学效应可能与激活bax表达、抑制 bcl-2和bcl-xl表达而活化caspase-3的信号通路有关。关键词姜黄素；结肠癌；lovo；细胞凋亡结肠癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤。随着人们 生活习惯和饮食结构的改变，我国结肠癌的发病率呈逐年上 升趋势。除了传

3、统的手术、放疗与化疗外，由于天然药物的 多成分、多靶点、多环节、多途径效应，使人们认识到'回 归大自然”的重要性，植物源化合物的抗肿瘤研究已逐步成 为临床抗肿瘤药物研究的热点。姜黄素是从草本植物姜黄的根茎中提取的一种天然多 酚，为姜黄的主要活性成分。在亚洲一些国家，姜黄素一直 被广泛地用作治疗炎症、哮喘、肝功能紊乱等疾病的药物、 食品着色剂和调味剂。此外，姜黄素还在许多肿瘤细胞中发 挥着抗炎，抗氧化，抗肿瘤和化学预防作用1-2。许多体 内外实验也证实姜黄素能抑制肿瘤生长，显著减少瘤体的数 目，减轻多种致癌因素对机体的损害3-5。由于姜黄素的 药理作用十分广泛，其抗癌作用机制较为复杂，目

4、前仍未完 全阐明。本研究拟探讨姜黄素对结肠癌细胞株lovo的增殖 抑制和凋亡诱导作用机制，为进一步阐明姜黄素的抗肿瘤机 制提供更多的实验依据。1材料1. 1药物及试剂姜黄素(c1386-10 g, sigma公司进口 分装，临用时以少量dms0溶解，再加培养液稀释至所需浓 度，其中dms0的终浓度 2.2透射电镜观察细胞超微 结构 用020 mgl-1梯度浓度的姜黄素作用lovo细胞24 h后，用0.25%胰蛋白酶消化离心，以0.01 mol l-l pbs (ph 7. 3)清洗2遍，1 000 rmint离心，收集细胞，迅 速加入 3%戊二醛固定 3 ho 用 0. 01 mol l-l

5、pbs (ph 7. 3) 浸洗3次，加2%琼脂使细胞成团凝固，于1%饿酸中固定2 h。 再用0. 01 mol l-l pbs (ph 7. 3)充分浸洗2次，梯度丙 酮(50%100%)逐级脱水，进入氧化丙烯。环氧树脂epon812 逐步浸透、包埋，最后在epon812中于60 °c下聚合48 h。 超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬铅双染后，透射电子显 微镜下进行观察。2. 3 pi单标法检测细胞周期 将020 mgl-l梯度浓 度姜黄素处理24 h的lovo细胞消化离心，收集各组细胞， 用 0. 01 mol l-l pbs (ph 7. 3)轻洗 2 次；1 000 r mi

6、n-1 离心5 min,弃上清，加入2 nil盐水g,吹打悬浮细胞，缓 慢加入6 ml预冷的95%乙醇，冰浴30 min, 4 °c固定4 h； 1 000 r min-1离心固定的细胞5 min,弃上清，加入0. 01 mol l-l pbs (ph 7. 3) 6 ml 混匀,1 000 r min-1 离心 5 min,弃上清；加入 1. 5 ml 0. 01 mol l-l pbs (ph 7. 3) 吹打均匀，重悬细胞，再加入1.5 ml的pi染液，避光染色 30 min后，以1x106个/ml上样流式细胞仪，检测细胞周 期分布。2. 4 annexin v-fitc和pi

7、双标检测细胞凋亡 将020 mgl-l梯度浓度姜黄素处理24 h的lovo细胞消化离心， 收集各组细胞，用0. 01 mol l-l pbs (ph 7. 3)轻洗2次; 1 000 r min-1离心5 min,弃上清，用500 n l ix膜联 蛋白结合缓冲液重悬细胞，加入5 nl annexin v- fitc避 光染色10 min,再加入10 u l pi于室温下避光孵育5 min； 上流式细胞仪检测荧光强度，分析细胞凋亡百分率。2. 5 rt-pcr 检测 bax, bcl2, caspase-3, bclxl mrna 表达水平将020 mg l-1姜黄素处理24 h的lovo细胞

8、 消化离心，收集细胞，选用axypreptmmultisource总rna 小量制备试剂盒提取细胞总rna,操作步骤按照试剂盒说明 书进行。提取的总rna经1%琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸蛋 白检测仪检测纯度和质量。取0.6 ug总rna应用逆转录试 剂盒进行cdna的合成。其余总rna存于-80 °c冰箱备用； 合成的 cdna 进行 pcr 检测 bax, bel-2, caspase-3, bcl-xl mrna表达水平，以p-actin为内参。pcr引物序列如下： bax (169 bp) ±游引物 5 -tgcttcagggtttcatccag-3', 下游

9、引物 5 -ggcggcaatcatcctctg-37 ； bcl-2 (300 bp) 上游引物 5 - gctctgaacagatcatgaagacag-37 ,下游引物 5 - caatccaaagtggacctgagg-3z ； caspase-3 (533 bp) 上游引物 5 -ctcggtctggtacagatgtcgatg-37 ,下游引物 5 -ggttaacccgggtaagaatgtgca-3' ； bcl-xl (379 bp)上 游引物 5 -ggagctggtggttgactttct-37,下 游引物5 -ccggaagagttcattcactac-37 ；

10、 3-actin (450 bp)上 游引物 5 -ctacaatgagctgcgtgtgg-37,下 游引物5 -tagctcttctccagggagga-37。反应体系为 20 ul： 10 u l premix taq, 0. 4 n l cdna, 0. 4 n l 上游引物，0.4 ul 下游引物，8.8 ul双蒸水，将上述所加的样品混匀，离心, 利用pcr仪进行扩增。反应条件：94 °c预变性4 min； 94 °c 变性30 s； 52 °c退火30 s； 72 °c延伸1 min；循环30 次；72 °c终末延伸10 min；

11、4 °c保温。取出pcr产物，利 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增结果，通过凝胶成像系 统扫描分析各条带，依据各条带的吸光度和面积对pcr扩增 产物进行定量分析，计算目的基因与内参(b-actin)扩增 条带光强度比值，可得出目的基因mrna的相对表达。2.6统计学分析应用spss 13.0统计软件进行统计分 析，数据均以土s表示。计量资料经方差齐性检验为方差齐 性，2组间差异采用t检验，多组资料应用单因素方差分析, p 3.2细胞超微结构观察透射电镜观察发现，对照组 lovo细胞具有完整的细胞膜，正常胞核、核膜及一些亚细胞 结构。姜黄素(5,101)处理24 h后，部分细胞出现

12、染色质核膜下聚集、胞质空泡化、但胞膜仍具完整性等 凋亡特征，20mgl-1姜黄素处理24h后，核膜出现破裂, 有凋亡小体形成(图2)。3.3细胞周期的测定pi单染后流式细胞仪来检测阳性 细胞的数量，实验结果显示，以020陀l-1姜黄素作用 lovo细胞24h后,go/g1期细胞所占比例为(54. 13±2. 06)%, (48. 51±1. 55) %, (45. 85±1.72) %, (43. 60±2. 67) %,(42. 91±2.48) %,各姜黄素组与对照组相比出现减少，s 期细胞所占百分比由对照组的( 35. 50±0

13、. 12) %增加为(38. 75±1 79) %,(48. 13±1.56) %,增加显著(pcurcumin inhibits(4493±385) %, (47. 68±3. 38) %,其中以5,10,20 mg l-l姜黄素组4 chen a, xu j, johnson a c.human colon cancer cell growth bysuppressing gene expression of epidermal grow th fac tor receptor through reducing the activity of the

14、 transcription factor egrlj. oncogene， 2006,25(2)： 278.5 aggarwal s, ichikawa h, takada y, et al. curcumin ( diferuloylmethane )down-regula. tesexpression of cell proliferation and antiapoptotic andmetastatic gene products through suppression ofikappabalpha kinase and akt activationj. molpharmacol,

15、2006,69 (1)： 195.6 魏鹏，李瑞晟，王虹，等.姜黄素对app/ps1双转基因小鼠突触相关蛋白表达的影响j中国中药杂志,2012, 37 (12)： 1818.7 冯慧利，李瑞晟，王虹，等.姜黄素对app/ps1双 转基因小鼠海马irs-1和p-irs-1表达的影响j.中国中药 杂志，2013, 38 (9)： 1290.8 陈晓培，李瑞晟，王虹，等.姜黄素对ad小鼠尿 中相关神经丝蛋白的动态影响j.中国中药杂志，2013, 38(9) ： 1310.9 kuttan r, bhanumathy p, nirmala k, et al.potential anticancer a

16、ctivity of turmeric (curcuma longa) j. cancer lett, 1985,29 (2)： 197._10 li l, aggarwal b b, shishodia s, et al.nuclear factor-kappab and ikappab kinase are constitutively active in human pancreatic cells, and their down-regulation by curcumin (diferuloylmethane) is associated with the suppression o

17、f proliferation and the induetion of apoptosisj cancer, 2004, 101 (10)： 2351.11 odot j, albert p, carlier a, et al in vitroand in vivo anti一tumoral effect of curcumin against melanoma cells j int j cancer, 2004,111 (3)： 381.12 goel a, kunnumakkara a b, aggarwal b b.curcumin as curecumin” : from kitc

18、hen to clinicj biochem pharmacol, 2008,75 (4)： 787.13 cory s , adams j m. the bcl2 family :regulators of the cellular life-or-death switchj. nat rev cancer, 2002,2 (9)： 647.14 kuo m l, huang t s, lin j k. curcumin, an antioxidant and antitumor promoter, induces apoptosis in human leukemia cellsj bio

19、ehim biophys acta, 1996,1317 (2)： 95.15 reed j c. bcl2 family proteins j oneogene,1998,17 (25)： 3225.16 sun l, xie p, wada j, et al. rap lb gtpaseamelioratesglucose-inducedmitochondrialdysfunctionj j am soc nephrol,2008,19 (12)：2293.17 li j, sun g z, lin h s, et al. the herbmedicine formula uyang we

20、i kang liuv improves the survival of late stage gastric cancer patients and induces the apoptosis of human gastric cancer line through fas/fas ligand and bax/bcl2 pathwaysj int immuno pharmacol,2008,8 (9)： 1196.18 nieholson d w, thornberry n a. caspases:killer proteasesj trends bioehem sci,1997,22(8

21、)： 299.19 rotonda j, nicholson d w, fazil k m, et al.the three-dimensional structure of apopain/cpp32, a key mediator of apoptosisj. nat struet biol,1996,3(7)： 61920 nicholson d w. caspase structure,proteolytic subs trot es, and func tion during apop totic cell deathj cell death differ, 1999,6 (11)：

22、 1028.21 muzio m, stockwell b r, stennicke h r, etal. an induced proximity model for caspase8 activationj. j biol chem, 1998,273 (5)： 2926.22 yang j, chang h y, baltimore d. essentialrole of ced-4 oligomerization in ced-3 activation and apoptosisj. science, 1998,281 (5381 )： 1355.study on functions

23、and mechanism of curcumin in inducing colorectalcarcinoma cells lovo apoptosisguo li-dal, 2, jiao zhen-xial, song yingl, tengwen-hua2, liu zhao2, liu jing-ze2*(1.department of environment and chemicalengineering, hebei college of industry and technology,shijiazhuang 050091, china；2. key laboratory o

24、f animal physiology ,biochemistry and molecular biology of hebei province, college of life sciences,hebei normal university,shijiazhuang 050016,china)abstract objective： to discuss the biological function and regulation mechanism of curcumin in promoting human colorectai carcinoma (lovo) cells apopt

25、osis. method： conventional in vitro culture in human colorectai carcinoma cells lovo, when 80%-90% confluence was reached , cells were treated with curcumin at different concentrations (020 mg l1). curcuminz s effect on cell proliferation level was examined by mtt colorimetry. the ultrastnicture of

26、curcumin一treated lovo cells were observed with transmission electron microscope (tem) the amount of pi-positive lovo cells after the curcumin treatment were determined by f 1 ow cytometry. the cell apoptosis rate was detected by annexin v-fitc/pi double staining the mrna level of bax, bcl-2, caspase-3 and bcl-xl were tested by means of rt-pcr.result： mtt test indicates curcumin could inhibite the growth and prolifera tion of lovo cells in a time- and concentration-dependent manner. tem examination showed that curcumin