透射电子显微镜生物样品常规制样技术

1、南京农业大学生命科学 实验中心电镜室 2010.6.21制样技术中所用的化学试剂制样技术中所用的化学试剂 一、固定剂一、固定剂 1、戊二醛、戊二醛 物理特性：带有刺激性气味的无色或淡黄色液体，熔点物理特性：带有刺激性气味的无色或淡黄色液体，熔点-14，沸点，沸点189，与水混溶。市售戊二醛一般为，与水混溶。市售戊二醛一般为25的水溶液，的水溶液，pH值在值在23.5之之间。间。 性性 能：穿透性强、固定迅速、能较好地保存酶的活性。能：穿透性强、固定迅速、能较好地保存酶的活性。 健康危害：对眼和上呼吸道有强烈地刺激性，长时间吸入或皮肤接健康危害：对眼和上呼吸道有强烈地刺激性，长时间吸入或皮肤接触

2、能致敏。触能致敏。 固定作用：醛类固定剂中的醛基对细胞结构具有很高的亲和力，能固定作用：醛类固定剂中的醛基对细胞结构具有很高的亲和力，能制样技术中所用的化学试剂制样技术中所用的化学试剂 较好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，对微管、内质网等细胞膜系统较好地保存糖元、核酸、核蛋白的特性，对微管、内质网等细胞膜系统和细胞基质具有良好的固定作用。和细胞基质具有良好的固定作用。 缺缺 点：对脂质不起固定作用。点：对脂质不起固定作用。 使用浓度：浓度范围为使用浓度：浓度范围为16%，一般常用浓度，一般常用浓度2%3%。通常用。通常用pH 6.87.5的的 0.2M 磷酸缓冲液配制。磷酸缓冲液配制。 2、四

3、氧化锇、四氧化锇 物理特性：四氧化锇俗称锇酸，强氧化剂；带有刺激性气味的淡黄物理特性：四氧化锇俗称锇酸，强氧化剂；带有刺激性气味的淡黄色结晶，熔点色结晶，熔点40，沸点，沸点130，低于沸点时升华，溶于水。市售四氧，低于沸点时升华，溶于水。市售四氧化锇一般为化锇一般为0.5克包装，密封于小玻璃安培瓶里，有剧毒。克包装，密封于小玻璃安培瓶里，有剧毒。制样技术中所用的化学试剂制样技术中所用的化学试剂 健康危害：吸入、消化道摄入和皮肤接触毒性很强，导致严重烧伤健康危害：吸入、消化道摄入和皮肤接触毒性很强，导致严重烧伤和刺激，蒸气、固体及溶液对皮肤具有腐蚀性，吸入会引起肺水肿。和刺激，蒸气、固体及溶液

4、对皮肤具有腐蚀性，吸入会引起肺水肿。 固定作用：由于它与氮原子有极强的亲和力，所以能与氮基、肽、固定作用：由于它与氮原子有极强的亲和力，所以能与氮基、肽、蛋白质反应，在蛋白质之间形成交联，使其稳定，而且不会形成沉淀。蛋白质反应，在蛋白质之间形成交联，使其稳定，而且不会形成沉淀。四氧化锇对脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。四氧化锇对脂蛋白、核蛋白有良好的固定作用。 缺缺 点：四氧化锇对点：四氧化锇对 DNA、RNA、糖元和微管等没有固定作用，、糖元和微管等没有固定作用，而且对酶的活性影响很大，因此在细胞化学和免疫电镜实验中应避免使而且对酶的活性影响很大，因此在细胞化学和免疫电镜实验中应避免使用。用

5、。 使用浓度：通常使用浓度为使用浓度：通常使用浓度为1%2%。制样技术中所用的化学试剂制样技术中所用的化学试剂 二、缓冲液二、缓冲液 磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（PBS)、 二甲砷酸钠缓冲液（二甲砷酸钠缓冲液（CAB） 三、脱水剂三、脱水剂 乙醇、丙酮乙醇、丙酮 透射电镜生物样品制备的基本要求透射电镜生物样品制备的基本要求 透射电子显微镜常规制样技术也称为超薄切片技术，它是根据透透射电子显微镜常规制样技术也称为超薄切片技术，它是根据透射电子显微镜的性能以及对生物样品的要求的一种样品制备技术。射电子显微镜的性能以及对生物样品的要求的一种样品制备技术。 超薄切片制样技术目前还存在一定的缺超薄切片制样技

6、术目前还存在一定的缺陷，制样过程中应根据研究目的的不同，对陷，制样过程中应根据研究目的的不同，对样品制作的要求应有所侧重。从组织形态学样品制作的要求应有所侧重。从组织形态学观点考虑，需要尽可能真实精确地保存结构观点考虑，需要尽可能真实精确地保存结构,忽略其组织的机能；从生物化学观点考虑，忽略其组织的机能；从生物化学观点考虑，主要研究的是组织和细胞的机能，对形态的主要研究的是组织和细胞的机能，对形态的要求有所降低。要求有所降低。透射电子显微镜常规制样步骤透射电子显微镜常规制样步骤 取材取材 醛类固定醛类固定 (前固定前固定) 缓冲液清洗缓冲液清洗 锇酸固定锇酸固定 (后固定后固定) 缓冲液清洗缓

7、冲液清洗 梯度脱水梯度脱水 环氧丙烷置换环氧丙烷置换 浸渍浸渍 包埋包埋 聚合（聚合（45、60） 修块修块 超薄切片超薄切片 铀染色铀染色 、铅染色、铅染色 取材的原则和基本要求取材的原则和基本要求 （1 1）取材部位要准确）取材部位要准确 根据实验的目的和要求，选取特征非常明显的正常或病根据实验的目的和要求，选取特征非常明显的正常或病变组织的部位。变组织的部位。 如果实验对象是经过一个系列方法（时间系列、浓度系如果实验对象是经过一个系列方法（时间系列、浓度系列等）处理，取材时要做到各阶段取材部位尽可能保持一致，这列等）处理，取材时要做到各阶段取材部位尽可能保持一致，这样最终的实验结果才有可

8、比性。样最终的实验结果才有可比性。 （2 2）取材要迅速）取材要迅速 为了使生物体活体时的状态能够完整的保存下来，取材时必为了使生物体活体时的状态能够完整的保存下来，取材时必须迅速。须迅速。 取材的原则和基本要求取材的原则和基本要求 生物材料特别是动物材料在离体后，由于组织细胞中的各生物材料特别是动物材料在离体后，由于组织细胞中的各种酶，尤其是溶酶体中的水解酶迅速释放到组织中，会造成蛋白种酶，尤其是溶酶体中的水解酶迅速释放到组织中，会造成蛋白质、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。质、核酸的降解，形成自溶。故取材后要迅速投入到固定液中。 （3 3）取材时的温度要低）取材时的温度

9、要低 主要是为了降低组织内酶的活性，减少蛋白质和核酸降解主要是为了降低组织内酶的活性，减少蛋白质和核酸降解的速率。的速率。 取材应在取材应在0 044的低温条件下操作，取材的器械和固的低温条件下操作，取材的器械和固定液也要预冷。定液也要预冷。取材的原则和基本要求取材的原则和基本要求 （4 4）材料的体积要小）材料的体积要小 通常戊二醛的渗透深度约为通常戊二醛的渗透深度约为 0.5 0.5 毫米，锇酸的渗透深度约毫米，锇酸的渗透深度约为为 0.25 0.25 毫米。由于固定液的渗透能力原因，为了使材料各部分毫米。由于固定液的渗透能力原因，为了使材料各部分能够得到迅速的固定，取材的体积不应超过能够

10、得到迅速的固定，取材的体积不应超过1 1立方毫米。立方毫米。 （5 5）取材时应避免损伤）取材时应避免损伤 取材器械要锋利，尽量减少由于挤压、牵拉所造成组织内取材器械要锋利，尽量减少由于挤压、牵拉所造成组织内部结构的损伤破坏。通常使用手术刀或双面刀片。部结构的损伤破坏。通常使用手术刀或双面刀片。 （1）动物取材）动物取材 一般将动物麻醉或急性处死后迅速解剖选取出所需要的组一般将动物麻醉或急性处死后迅速解剖选取出所需要的组织器官，放入预冷的固定液中，然后再在滴有预冷固定液的蜡板织器官，放入预冷的固定液中，然后再在滴有预冷固定液的蜡板或泡沫板上，用新的锋利的刀片切成或泡沫板上，用新的锋利的刀片切成

11、1mm3左右的小块，用牙签左右的小块，用牙签轻轻挑入到装有预冷固定液的玻璃小瓶内，置于轻轻挑入到装有预冷固定液的玻璃小瓶内，置于4条件下低温条件下低温固定。固定。 对于特殊材料如神经组织或脑组织，可用原位固定或灌流对于特殊材料如神经组织或脑组织，可用原位固定或灌流固定，待组织适度硬化后再取材。固定，待组织适度硬化后再取材。取取 材材 方方 法法取取 材材 方方 法法 （2 2）植物材料）植物材料 植物材料的取材较为容易，材料离体后的变化不会像动物植物材料的取材较为容易，材料离体后的变化不会像动物材料那样快。但仍需要尽快投入预冷固定液中固定。植物材料表材料那样快。但仍需要尽快投入预冷固定液中固定

12、。植物材料表面的毛刺需要组织软化处理，表面有蜡质的叶片要进行脱蜡处理，面的毛刺需要组织软化处理，表面有蜡质的叶片要进行脱蜡处理，再用双蒸水清洗数次后，取材固定。再用双蒸水清洗数次后，取材固定。 植物叶片可切成植物叶片可切成1mm1mm宽、宽、2 23mm3mm长的长条状，直径小于长的长条状，直径小于0.5mm0.5mm的幼根可直接取的幼根可直接取2 2 3mm3mm长一段。长一段。 由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，由于植物材料常常漂浮在固定液表面，不利于固定，取取 材材 方方 法法 因此，需要适当的抽气使材料沉入固定液中，从而达到充分固因此，需要适当的抽气使材料沉入固定液中，从而

13、达到充分固定的目的。定的目的。 （3）野外取样方法）野外取样方法 准备好装有冰块的保温瓶，放入一定量的戊二醛固定液和缓准备好装有冰块的保温瓶，放入一定量的戊二醛固定液和缓冲液。取材时，可先取比标准体积稍大的组织块，放入固定液内，冲液。取材时，可先取比标准体积稍大的组织块，放入固定液内，带到实验室后再切成标准块。带到实验室后再切成标准块。切切 片片 染染 色色 切片染色通常采用铀切片染色通常采用铀铅双染色的方法。铅双染色的方法。 染色时间：文献或资料上推荐一般为铀染染色时间：文献或资料上推荐一般为铀染15153030分钟；铅分钟；铅染染10101515分钟。分钟。 由于由于H7650H7650透射电镜具有高反差功能以及配备了高灵敏度透射电镜具有高反差功能以及配备了高灵敏度的底插式的底插式CCDCCD，图片反差强，因而，在切片染色时间上需要做一，图片反差强，因而，在切片染色时间上需要做一个适当的调整。个适当的调整。 对于生物样品而言，染色要根据样品的特性、观察目的以对于生物样品而言，染色要根据样品的特性、观察目的以及温度等因素，染色时间要有所不同