微柱液相色谱-双电极电化学法测定脑微透析液中单胺类递质的含量

1、微柱液相色谱双电极电化学法测定脑微透析液中单胺类递质的含量第?卷第?期?年?月色？谱?微柱液相色谱?双电极电化学法测定脑微透析液中单胺类递质的含量叶惟泠?尹萍波?梅镇彤?中国科学院上海生理研究所?上海?提?要?用微柱液相色谱?双工作电极电化学检测法?分析了麻醉大 口鼠纹状体微透析样品中的单胺类递质及其代谢产物的含量?无论在上游 的氧化电位或下游的还原电位进行检测?至少在?范i韦i内？?浓 度与响应的线性关系良好?检测极限可达?以下?对于检测的优点和 需要注意的问题作了扼要的讨论?关键词?微柱液相色谱?双电极电化学 法检测?分析微透析液?单胺类递质分类号?u?前言屮枢单胺类递质从神经元末梢释放后

2、?？由于被迅速代谢和神经元的重 摄収作用?使这些递质在脑内微透析实验的收集液?即微透析液?中的浓 度非常低?难以用常规柱液相色谱分析法检测?微柱液相色谱分 析具有省溶剂和增加灵敏度的优点?双电极电化学检测可提高检测 的灵敏度?选择性和对流出组分的鉴别能力?用微柱液相色谱?双 电极电化学法检测?分析微透析液中的单胺类递质在我国尚未见报道?本 工作应用这一高效分析测试技术?测定了麻醉动物脑透析液中微量单胺类 递质?并对此分析法作了讨论？单胺类递质的去甲肾上腺素?肾上腺素?多巴胺?拜色胺?？以及它的代谢产物?二轻基苯乙酸?高香草酸 ?疑眄|卩朵乙酸?的标样和离子对试 剂己烷磺酸钠均购口 ？?公司？乙

3、月青为?公司?级试剂?其余为国产分析纯试剂?所有标样贮液?(!?都用?u?高氯酸配制?再用人工脑脊液?稀释至所需浓度？?透析样品的采集透析实验的仪器设备和灌流使用的?组成同前文?除了抗坏血 酸改为?(!?外?实验动物为雄性?纯种 大鼠?体重?左右?动物在三漠乙醇的麻醉下?按每?体重腹 腔注射?三漠乙醇的剂量?固定在?型?等的大鼠?立体定位仪上?按?？?材料和方法?仪器和试剂 脑定位图谱?将自制的同心型探头?尖端直径? a ?透析膜有效长度?插入纹状体?开始灌流和收集透析样品?灌高效液相色谱仪为美国?公司?系列?？?微流量泵?六通进样阀?接?？ a ?进样环？微柱？流速度为? a ?£

4、1?每?收集一管?探头使用前?将 探头尖端浸没在每种标样浓度各为?？ a ?£1?的混合标样溶液中?在相 同流速和室温条件下测试英体外回收率?本文比较了基础条件?高钾刺 激? 浓度为?浓度以维持（1?相应降低?粒径?a?用?个?安培型检测器分别控制?个玻碳工作电极?？ 上游电极?和下游电极?对一个?说?参比电极的电位分别设置为?氧化?和?还原?灵敏度均为?双通道的同时 采集?储存?处理和色谱图及数据的激光打印都在色谱工作 站？?电脑？公司提供 的?色谱资料分析软件?上进行？e国家自然科学基金资助项目？?基金号?本文 q 攵稿 h 期？?？?？?？巾參回日期？?等渗?和深度麻醉造成大鼠

5、窒息死亡后纹状休透析液内单胺类递质及其代谢产物的水平？?色谱条件等比洗脱单胺类递质及其代谢产物的流动相的色?谱?卷缓冲液组成?u?为?乙酸钠?柠檬酸?？己?烷磺酸 钠？缓冲液？乙月青？ b ?uu?流速?？ a ?为了防止溶于流动相的微量氧气损 伤玻碳电极和造成噪音?流动相除了用超声脱气外?还在储液槽与泵之间 在线?连接了？?型 口动真空脱气装置?？量释放的透析液色谱图？由于采用了上述串型相邻式的设置?图? 的非保留杂峰明显比图?的少?在?出峰前基线已回落?且低而平 稳?从而保证了准确的定量测试?用这种设置分析儿茶酚化合物时?将 在?？ 上测得的电流值?响应?与在?？ 上测得的值之比定义为收集

6、系数?表?列出了 ?在?种不同浓度的标样及?和?纹状体 不含巧7>7>7> ”存”i i i ?结果和讨论双工作电极有并型相对?并型相邻和串型相邻三种排列方式?由于并型相对式很少应用?因而在分析单胺类递质及其代 谢产物时?我们仅对后两种排列方式作了比较?并型相邻式可在两个工作 电极上分别设置两个大小不同的氧化电位?利用同一流出物同时在两个电 位所得响应的比值对该组分作进一步定性?且可用于同时检测流出液中的 易氧化和难氧化的组分?但由于两个电位间的相互t扰?造成噪音较串型 的大?影响了检测灵敏度?串型相邻式可在?？ 上测试时受非保留峰干扰?不能准确积分?在牛物样中的收集系数?由

7、表?可见?收 集系数不随样品浓度的变化而改变?因而也能作为一种定性的依 据?收集系数的很好的重复性?使这些儿茶酚化合物不仅在?？ 在?？ 上而且上测试时?其浓度?至少在? a ?£i?范围上也有一定的响应?其中?和?？ 内?与响应的线性关系都很好?和? ?约为它们在?？ 上响应的?约为在 上的?(!?其原因可能是它们在?上被氧化后 上设置较小的?在?？上设置较大的氧化电 的产物也有一定的还原性?但它们在?重复性远比在? 上响应的位?并设置不同的检测灵敏度?单胺类递质的氧化电位都在?左右?而它们带甲氧基或甲基代谢产物的氧化电位都在?左右?如果这些代谢产物的色谱峰干扰递质峰的检 测?微透

8、析液中总是递质含量低而代谢产物含量高?时?这样设置是合理 的?单用氧化电位检测时?较早被洗脱的?等儿茶酚化合物的色谱峰极易受非保上的差?因而线性关系也差？由于儿茶酚化合物在?上的分析具有上述优点?所以上的响应来计在表?列出的大鼠纹状体透析液分析的结果中?？?和？ ？是按它们在？ 算的?在微透析实验屮?通常用探头的体外回收率来校正透析液屮测 得的牛物活性物质的含量?使其接近于它在细胞间隙的实际水平? 本实验测得?和？的回 收率？ 依次为？和？ 表?屮的数据均是经回收率校正的值？由表?？留峰的干扰?微透析样本难以前处理?因而这种干扰十分明显?但这 些儿茶酚化合物具有在上游氧化电位被氧化后?迅速在下

9、游还原电位被还 原的电化学特性?而微透析液中某些具有电化学活性的杂质?如抗坏血酸?无此可逆性?利用这些电化学特性?我的数据可看出?高?刺激导致递质释放较基础状态急剧增高?而代 谢产物水平基本不变?死亡时递质大量释放?代谢产物含量成倍降低?这 些变化趋势与前人报道?的基木一致？们在?？上设置氧化电位?在?上设置还原电位?很好地排除了非保留杂峰的干扰?见图?图?是动物麻醉窒息死亡时因应激而导致生物活性物质大表?种儿茶酚化合物的收集系数?？ v ?tap 入 £?巾欲0小訣3£4)4)0(1册屮？£0?？0(|)4)01皿唧0 入x0?0 uv6a?v?化合物?/?j?

10、 ?标样？?a?u? ?a?u? ?a?u?透析液?期?叶惟泠等?微柱液相色谱?双电极电化学法测定脑微透析 液中单胺类递质的含量?表?大鼠纹状休透析液?？ v ? 屮单胺类递质及其代谢产物的含量?(!?ta3入 £?tr)£xovt£vto?£av?？?o4)?ovoa?iv£tpavo?ivc£poj?av6tr| 8ip?8tapoxiteoiv6iaxi|joat8o?v? 4)po ?parorpiaru? ?基础水平?高?刺激？死后？u? ?图?大鼠纹状体微透析液色谱图(diy?xr|po?atoypa?o(j)?ixpo6

11、iaxipoate(j)po?tnepatotpiatu?施加电位?对?tl?氧化？还原？?u? ? ?微柱液相色谱最适用于含量低?体积小而又难以前处理浓集的生物样本的分析?其中尤以微透析液的分析最多?这 与近年来微透析技术的广为采用密切相关?参考文献?尹萍波?梅镇彤?生理科学进展？叶惟泠？尹萍波？色谱？?王俊德?商振华?郁蕴璐?高效液相色谱法?北京?中国?微柱的柱床体积小?柱外效应的影响尤为明显?因此?微柱色谱必须使用与之相匹配的连接系统?？ 进样阀和池体积小? a ?时间常数小的检测器?使柱外?特别是 柱后?扩散的影响降到最低限度?柱是一种新型高效微柱? 它无需管道而直接连接在进样阀和电极

12、块?池体积在?？? a ?可调?之间?基本上排除了柱后扩散的影?纪华民?汪尔康?色谱?£ga? ?叶惟泠？色谱？? ? ? ? ? ? ? ?响?与用常规柱系统的同类分析相比?灵敏度可提高约?？倍?检测极限可达?以下?用微柱色谱分析时?缓冲 液各组分的盐浓度最好为?微柱?特别是填料粒径为?？ a ?的微?u?柱?较常规柱更易被污染而堵塞?因此需用孔径小于或等于?？a ?的微孔滤膜过滤流动相?在体灌流的微透析液可直接进样?脑?血液? 组织?体液等生物样本?经用微透析或超滤法前处理后?也是微柱分析理 想的样本？色?谱?卷mixpopopeai0ui6xnpo?atoypa?r）ipu）itq?uaaex8xpo6sexexipox h £ ?ixax?etexovo（|）movoa?ivetpavo?itt£paivbpaivmixpo6iaxi|joateo? ?inavyr）ailvoriturso（j）nripoioaoyip?tr|8xqiv8asaxa6e?ipo（|）2xievxea? ?zqavynctl?abcrcpaxt? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 巧巧门巧？巧？巧