细胞培养技术总结-重要

1、细胞培养及检测相关技术小结-、 细胞培养基配制以1000ml培养基为例。1000ml成骨细胞培养基=850ml a -mem培养液+ 150 ml特级胎牛血清fbs (15%)(1) . a mem powder:10. 2 g/l& 67 g for 850 ml(2) . nahc03:2.2 g/l 1.87 g for 850 ml(3) . twice distil led water 850 ml, di ssolve the powder in water(4) . fbs (15%, v/v) 150 ml(5) . filter to sterilized bottl

2、e(6) . labe1 the bottle and store in 4°c.notes: 4, 5 should be operated in the sterile working place. and if necessary, we can add some antibiotics into the medium (usually in primary cell culture).二、pbs (10x)nacl: 80g/lkc1: 2g/lna2hp04： 14.4 g/lkh2p0i： 2.4 g/lph二7. 4, with hc1 or naohtoo much

3、po产is harmful to cell, so only very little amount is necessary. get some certain to dilute this 10 times concontration pbs whon we need.三、胰蛋白酶trypsin- edta消化液(10x)this solution is used for cel 1 released from the culture flask。the final concentration of edta is 0.05%;the final concentration of tryps

4、in is 0.53 mrnol/l.take 40 nil solution for example (10x)(1) . trypsin: 40mlx0. 05%x10 =0. 02g(2) . edta: 40mlx0. 53x 10 3x376(molecular weight) x1010 =0.0797g(3) . pbs 40 ml（4）. filter and distribute it into 2 ml sterilized tubes.四、细胞冻存液细胞冻存液是dmso （二甲基亚砚）和fbs的混合液，dmso与fbs的体积比为1： 2,混 合均匀后过滤，加0.5ml混合

5、液入灭菌过的冻存管，放进-20°c冰箱中备用。五、传代细胞买来时，多为老细胞，细胞活性不强，因此，盂要先传代以恢复其活性。细胞刚买 来时，培养瓶里面一般都装满了培养基，在操作时，需要先将培养基移出至干净灭菌的管子 备用。1. 取光镜观察己长满细胞的培养瓶（下面按一瓶计算加入液体最），进行消化：a）吸取19ml pbs （需用小滤膜过滤去除细菌等）b）弃去旧培养基c）用5ml pbs晃洗培养瓶，弃去pbs,并重复一次。d）在剩余的9m 1 pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液为10倍于正常浓 度）。过滤后加入培养瓶中。如果细胞贴壁不牢，只需要加一次，2ml；如果细

6、胞贴 壁牢固，第一次可加入35inl,水平晃动儿秒后弃去，再加入2ml消化液，晃动并 轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下來吋，加 入10ml细胞培养液，并将细胞液移至离心管。2. 离心,1200rev/min, 5niino弃去上清液,晃动离心管使细胞分散,加入培养基10ml, 用两个培养瓶分装细胞液；3. 标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。notes： 1.细胞不能长吋间处于无液体状态，因此在每个步骤之间，应该作好准备工 作，如在步骤l.c）和ld）z间，应该先准备消化液，再弃去第二次的pbs清洗液。2. 通常情况下，成骨细胞的贴壁力较强，因此口j以弃去第一次

7、的消化液，再 加入第二次；反之，如遇到贴壁力较弱细胞，加入一次消化液肉眼可见细胞明显脱落， 则只需加入这一次消化液。3. 在显微镜下观察细胞脱壁情况时，细胞呈圆形并聚集成团，水平晃动培养 瓶时，细胞跟随瓶子晃动，在此，要确认细胞完全从瓶壁上消化下来。4. 在分散离心后的细胞时，耍确认细胞分散均匀，因为成团的细胞不利于细 胞住长，并且对ldh等实验结果影响较人。六、换液传代后，细胞牛长何两天就需要换一次液，以补充细胞牛长所需的养分。换液询，需在 显微镜下观察细胞的生长状态，要特别注意细胞是否被污染,如果是被污染，应弃去污染的 细胞。换液时，弃去ii培养基，加入新鲜培养棊，每瓶5ml。day 0d

8、ay 1day 2day 3day 4day 5day 6day 7七、冻存细胞（缓冻）1. 灭菌细胞冷冻管，灭菌前，半旋开管盖，灭菌完毕以后，旋紧；2. 取出已准备好的细胞冻存液（见四）；3. 按照传代的操作（见五）将细胞脱壁，分散后加入适最培养基，然后计数细胞，冻 存细胞时细胞的最佳密度为le6 cells/ml；4. 1ml细胞液进细胞冻存管（已有0.5ml细胞冻存液，混合均匀）；5. 适量界丙醇c3h70h进冷冻盒；（丙醇为一种冷冻介质，使冷冻速度为1 °c/min）6. 把冷冻悖放进冷冻盒，放进70°c的冰箱；7. 一周后（一般大于24h即可），取出冷冻盒，把冷冻

9、管放进液氮中t70°c冻存。notes: dmso is harmful to cells at room temperature, but can protect cells atvery low temperature.八、细胞复苏（速溶）1. 液氮中取出冷冻管，迅速放入小烧杯中，注意小烧杯中的水应该低于冷冻管口避免 污染，待细胞液融化后，用酒精擦拭管1丨，然后打开管盖将细胞液移至已火菌烧杯；之 后缓慢地加入10ml培养基,在omin内完成,（缓慢地让细胞内的dmso释放出来）。2. 分装细胞液，5ml/瓶，第二天换液去掉冻存液中的dmsoo 九、骨髓细胞原代培养（综合上述各步骤

10、）:1. 购买约大鼠3只；灭菌实验用的器具。2. 用乙讎麻醉后，敲碎头盖骨，并剪断颈椎，致死。3. 剪开腿部皮肤及肌肉，取出上肢骨和下肢骨（要从关节处剪开，此时不应眾露骨髓 腔），用pbs浸泡。4. 用手术刀、剪、切断骨的两端，可见骨髓腔，并用已过滤（0.22um滤膜）的培养 基,冲洗骨髓腔,收集冲洗液（含骨髓细胞）。5. looorpm的速度离心冲洗液。6. 弃去离心管中上清液，加入新培养基，并加入抗生素（青霉素和链霉素各200u/ml, 此浓度为正常浓度的两倍，主要是考虑到操作过程有染菌的可能）。7. 分装至培养瓶中，每瓶5ml含骨髓细胞培养基，置于培养箱中培养。8. 培养三天后，更换培养

11、基，依山加入200u/ml的青霉索和链霉素，继续培养箱培 养。9. 培养两天后，更换培养基，依旧加入200u/ml的青霉素和链霉素，继续培养箱培 养。1（）.培养两天后，更换培养基，依i口加入200u/ml的青霉素和链霉素，继续培养箱培 养。（原代培养的前一星期需加抗生索抑菌，后面培养中则不盂加抗生索）11. 培养两天后，更换培养基，不加抗生素，继续培养箱培养，隔两天换液。（一般在 星期一、三、五进行换液）12. 约培养两星期后，可见小鼠骨髓细胞生长良好，已长满25cn?培养瓶的底血，此时 可以冻存部分细胞，以备f次实验使用，冻存过程如下：a）用2倍于常用浓度的trypsin+edta进行消化

12、。b）消化后，加入适量培养基（至少与消化液等量的培养基，以保护离心过程中消 化液对细胞没有过大伤害）,1500卬m下离心5min0c）弃上清后，振荡分散均匀，然后加入培养棊稀释成4ml的细胞液，细胞计数。d）冷冻小瓶屮预先加入0.5ml的冻存保护液，然后再加入lml的细胞液（保护液 为fbs： dmso=2： 1,则培养瓶中液体的配比为一培养基：fbs： dmso = 6： 3： 1）,写上细胞名称，传代数，细胞浓度，操作人，时间。冻存浓度：lc6 cclls/mle）将冷冻小瓶放入冷冻盒内，盒内预先加入正丙醇或界丙醇（使温度变化缓慢, 保护细胞）,置于70°c低温冰箱中冻存一星期后

13、,转移到液氮内冻存即可。13. 冻存细胞的复苏：a）取出冻存小瓶，常温解冻后，向溶解的细胞液中加入8ml培养慕，此培养基 慢加，一般在10分钟左右加完。b）分装至培养瓶或培养皿中。十、mg63细胞株培养细胞株可以无限快速增殖，平常只需正常换细胞培养基（两天一次），传代（细胞长满 培养瓶底部即可，一般为一周次）。检测方法： cytotoxicity检测细胞毒性 ldh< proliferation and viab订ity of the cell检测细胞增殖和细胞活力: mtt, alamar blue functional secretion of the cell 细胞功能代谢：-al

14、p （碱性磷酸酶为细胞分化早期标志物） immunofluorescence stain：细胞骨架和其它特异蛋白。morphology of the cell on material surface 形貌观察: sem, phase contrast microscopyldh （般不选此方法）ldh是一种检测细胞损伤程度的方法，所以一般不采用本方法检测成骨细胞在材料表面 的增殖分化，只用于检测某材料对细胞的毒性有多大。在材料表面种卜细胞，细胞会在材料表面贴壁牛长，如果材料的牛物功能性不好或有细 胞毒性，就会损坏细胞。ldh是乳酸脱氮酶，只存在于细胞膜内，因此细胞膜损坏后，ldh 会释放在上清

15、液中。加入ldh reagent后，溶液显色，呈淡兰色，这是一个酚动力学反应过 程。颜色越深表示ldh的最越多，因此细胞损伤越严重。它是一种检测材料和细胞刚刚接触 的一个反应，所以应在细胞种上之后马上作此实验。对于药物而言，这个实验并不是必须, 因为药物对细胞不会马上有毒性，所以一般对药物不做ldillacatate + nad+pyruvate + nadh + h+1、灭菌样品、银子及所需实验器具；2、配制无血清的培养棊（1 ml/wel 1）ml99:9. 5 g/lnahc03:2.2 g/ltwice distilled water过滤备用；3、取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下面按一

16、瓶计算加入液体量），进行消化：a）吸収19ml pbs （需用小滤膜过滤去除细菌等）b）弃去旧培养基c）用5ml pbs晃洗培养瓶,弃去pbs,并重复一次。cl）在剩余的9ml pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液为10倍于 正常浓度）。e）吸取5ml上面的消化液至培养瓶中，晃洗3-5秒后，弃去。f）再加入2nd消化液进行彻底消化（适当弹弹培养瓶外壁后，在倒直光镜下 观察是否消化完全）。g）接着向培养瓶中加入10ml培养基后，转移至15ml离心管，在1200rpm下 离心5mino4、弃去离心管上清（注意应剩余约0. 5ml上清），振荡，使离心管内的细胞分散均匀;加入过滤

17、后的无血清培养基适量；5、计数细胞，ldh实验的细胞最佳浓度为5e4 colls/ml；6、把实验样品放入无菌的24孔培养板,向每孔中加入lml细胞液;同时,做8孔的 标准曲线（细胞浓度呈梯度稀禅，细胞浓度分别是100%、50%、25%、12. 5%、6. 25%、3. 12%. 1.6%、0%）；然后,将培养板放入孵化箱培养两个小时;7 配制 ldh reagent；buffer4.92g tris base5.95g nacl500 ml twice di still ed water, ph 7. 2 wi th iic1reagent solution297mnadh lomg/ml

18、inbuffer187mpyruvat lomg/mlin buffer10. 0mlbuffertriton-pbsdissolve triton in pbs, final concentration is 10%.8、两小时后将培养板収出，在标准曲线的第一孔中吸出50ul±清液做阴性对照；之 后在标准曲线的每孔加入20ul 10%triton液（破坏细胞）；9、取一个无菌的96孔培养板，根据样品的数量以及标准曲线的数量（一般要做两组 标准曲线），每孔加入200ul reagent液，然后分别加入20"标准曲线及样品上 清液进有reagent的96孔板孔屮；10、把96

19、孔培养板放入酶标仪读数，并分析结果。ldhldh星（细胞损伤程度）样品编号免疫荧光染色1. 配置溶液：固定液:pbs+formalin （pbs+甲醛）0. 5mlparaforma1dehyde 37%9.5mlpbspbs+fbs （或 pbs+bsa 小牛血清白蛋白 bsa/ pbs二ig/100ml）400mfetalcalfserum20mlpbs5m1caclstocksolution lmol/1 （帮助结合抗体）2. 染色过程：a）用固定液固定细胞，最少20分钟（可维持很长时间，没有影响）；b）用pbs清洗多余的固定液，防i匕后续步骤屮的fbs或bsa与材料交联，清洗三次, 每

20、次lomin；c）用 triton x （triton x： pbs=o. 2： 100, v/v）破坏细胞膜;d）使特异性蛋白与抗体结合到pbs-fbs, 0° c, 5min；e）用pbs + fbs清洗样品,三次,每次lomin；f）elisa方法染特异蛋白：i. primary antibody in pbs-fbs at rt （在恒温水箱里，37 度），lh；ii. 用pbs+fbs清洗样品，洗三次，每次lomin；（重要，洗掉未与材料相结 合的一抗iii. sec. antibody 1:50 （体积比）in pbs-fbs（一般每个样品可滴 0. 02ml）, lh；

21、note：在材料表而加入一抗和二抗吋，应把材料移到培养板另外干燥和洁净 的格子里；一抗与细胞表而的肌动蛋白结合，二抗与一抗结合，j1带有大量 的荧光染色成分，从而使特异性的肌动蛋白显色。g）加入 phalloidin tritc 0. 1-1mm （stock 100pm in dmso） sigma p1951：染细胞 骨架h）加入dapi 0. 5g/ml：染细胞和i）2x1 omin wash in pbs-fbs （最后液体不用吸掉）adhesion time.green: vinculinrod:f-actinblue:nucleusrat bone marrow cells on

22、stainless steel. 8hmtt：mtt是一种无色或淡黄色的物质，活细胞的线粒体及细胞质会与之作用，使其还原生成一种蓝黑色的晶体。这种晶体只能溶于1性有机溶剂，故还需要加入mtt lysis buffer,破坏细胞膜溶解蓝黑色晶体，此溶液的吸光波长x =570nmo1. 取光镜观察已长满细胞的培养瓶（下而按一瓶计算加入液体量），进行消化：a）吸取19ml pbs （需用小滤膜过滤去除细菌等）b）弃去【口培养基c）用5ml pbs晃洗培养瓶，弃去pbs,并重复一次。d）在剩余的9ml pbs中加入lml的trypsin+edta消化液（消化液为10倍于 正常浓度）。e）吸取5ml上面

23、的消化液至培养瓶中，晃洗3-5秒后，弃去。f）再加入2ml消化液进行彻底消化（适当弹弹培养瓶外壁后，在倒置光镜下 观察是否消化完全）。g）接着向培养瓶中加入10ml培养基后，转移至15ml离心管，在1200rpm -k 离心5minoh）弃去离心管上清（注意应剩余约0. 5m 1上清），振荡，使离心管内的细胞分 散均匀（重要！分散不均的细胞液可造成较人偏差，并且后面的步骤很难 进行分散）。2. 96孔培养板中每孔加looul培养液，算出所需的培养液，然后用相应体积的培 养基稀释上而分散好的细胞液，再按looul/孔的加入量，加至96孔培养板中, 置于培养箱中培养24天。3. 观察细胞接近长满培

24、养板底部时，可以消化-培养瓶细胞，接种至培养板中， 并进行梯度稀释（用于获得细胞浓度一吸光值的标准曲线）；宜于培养箱中培养 1天后,可进行mtt测试。4. 配制mtt原液：称6mgmtt溶于12ml培养基中。5. 弃去培养板屮的旧培养液，加入looul/孔的mtt原液，置于培养箱培养24 小时（2小时，取出观察反应悄况，细胞内线粒体处呈小黑点，细胞外呈针状晶 体）。6. 弃去板中mtt液体,并加入150ul/孔lysis solution,溶解细胞内的黑色生成 物。7. 用酶标仪测570nm （参考波长630nm）下的吸光值。alamar blue testcelltit«-blue

25、 reagentores az ur inresorufinemits fluorescerc© at 59cnmadd reagent to c«lls in culturea0.7rewminbresaainnincubato al 3尸 c for 1-4 hoursfluorome(erreccrd fl(x>resc«xealamar blue可以进入细胞膜而不破坏细胞，经细胞代谢后培养基由兰色变成粉红色，通 过检测粉红色培养基的吸光度从而得到细胞的活性程度。细胞活性越强，培养基的粉红色 越明显。1. 配制无酚红的培养棊(0. 5ml/wel 1

26、)ml99 (instained ml99): 9.6 g/lnahc03: 2.2 g/ltwice distilled waterfbs: 10% (v:v)alamar blue: 10% (v:v)过滤备用2. 在实验前先观察细胞，若细胞只长在样品上，则不需要换板；若细胞不仅长在样品上还 贴壁在培养板上，则盂将样品移至新孔；3. 弃去样品孔中的ih培养基，用过滤后的pbs液清洗一次，如需换孔，则在新孔中先加入0. 5ml无酚红的培养棊，然后将样品依次移到新孔中；如不需换孔，则弃去pbs后直接 加入无酚红的培养基；4. 同时，弃去标准illi线小的上清液，用过滤后的pbs液清洗一次，加入

27、无酚红的培养基0. 5ml/well；a）注：标准曲线应提询一天准备，按照传代的操作，在24孔无菌培养板中种下细胞,浓度分别为 100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.12%、1.6%、0%, 100%孔中的细胞液浓发为le5 cells/mk5. 将培养板査于孵化箱培养24小时（观察：兰色的培养基逐渐变成粉红色，即可）；6. 时间到后，取出板子，如果标准曲线不同浓度之间的粉红色差界明显，则可，収出板子, 吸取200ul/well进96孔板，置入酶标仪中读数即可。三天以后，垂复上述操作可得多一组实验数据。alamar bluealamar blue2 样品编号碱性磷酸酶(alp)4 - npp +h20 alp > np + pi反应物:4-nitrophenyl phosphate (4-npp),无色。产物：nitrophenol (np)，黄色,405nm处有最大吸收峰。alp的量与nitrophenol的生成速度成正比。1、配alp缓冲液(5x)：15.14 g tris-base