小徐的分生危机第二弹 dna复制

1、第八章第八章:dna复制复制meselson 和和stahl的实验的实验m. meselson and f.w. stahl. 1958. the replication of dna in escherichia coli proc. natl. acad. sci. u.s.a. 44: 671-682. m. meselson 和 f. w. stahl 很想想出一种办法来证明watson 和crick的半保留复制模型. 1957年, 他们成功获得了dna半保留复制的实验证据. 他们是采取的密度梯度离心的方法. their paper was published in 1958 and

2、ever since, the experiment has often been referred to as: one of the most beautiful experiments in biology. how it began:cscl 密度梯度离心分离密度梯度离心分离dnaa. the meselson-stall experimentb. the interpretation(cscl gradient centrifuge) (cscl gradient centrifuge) n15 n14n15 dnadnasemi-conservationreplication dn

3、a dna 复制中的一些问题复制中的一些问题l酶酶l拓扑异构问题拓扑异构问题l方向问题方向问题: 半不连续复制半不连续复制l启动启动ldna dna 合成的化学反应合成的化学反应ldna dna 多聚酶多聚酶 dna polymerasel复制叉复制叉 the replication forkthe replication forkldna dna 复制过程复制过程chapter 8 the replication of dnal原材料原材料l反应方向反应方向 l化学反应化学反应 l引导引导 dna合成的力量合成的力量 dna dna 合成的化学反应合成的化学反应 dna 合成所需要的底物合成

4、所需要的底物ldna 合成机理的图解the chemistry of dna synthesisthe chemistry of dna synthesisdna polymerasedna polymerasethe replication forkthe replication forkthe replication processthe replication processchapter 8 the replication of dnadna dna 多聚酶多聚酶ldna 多聚酶l dna 多聚酶的机理 dna 多聚酶有很多种类 dna多聚酶亚基起到的作用 功能功能机理机理细菌的细菌的

5、dna多聚酶多聚酶 dna pol iii 全酶全酶的组成的组成滑动夹滑动夹 sliding clampsl围绕新合成的双链围绕新合成的双链dna和与引物相连的聚合酶和与引物相连的聚合酶l确保了确保了 dna 与相同底物的再次结合，因此，与相同底物的再次结合，因此，增强了增强了pol的连续合成能力的连续合成能力.l真核生物的滑动真核生物的滑动dna夹是夹是 pcnasliding dna clamp滑动 dna 夹在所有的生物中都有发现，并且具有相似的结构滑动 dna 夹增强了连续合成能力真核生物的真核生物的dna多聚酶多聚酶 多聚酶开关多聚酶开关 代替 dna pola/引发酶的过程 需要

6、pold 或 dna pole. dna polymerasedna polymeraselthe specialization of dna polymerasesl the mechanism of dna polymerasemechanismfunctionthe specialization of dna polymeraseskinds of dna polymerases the role of the subunits of dna polymerases拇指拇指手指手指手掌手掌l催化加入和移除 dntps的催化位点. l与两个金属离子结合，并因此改变的催化位点的环境. l增强

7、磷酸键的稳定性dna 聚合酶手掌结构域聚合酶手掌结构域l结合到导入的dntp, 将可以正确配对的dntp 导入到催化位点l扭曲了模板链，使得模板链上的将要进行配对的一个核苷酸暴露出来，与dntp结合。dna 聚合酶手指结构域聚合酶手指结构域l不直接参与催化l与合成的dna作用来维持引物和催化位点的正确位置, 并且维持了 dna pol 和它的底物之间的强烈相互作用.dna 聚合酶拇指结构域聚合酶拇指结构域dna 聚合酶手掌聚合酶手掌结构域结构域dna 聚合酶手指聚合酶手指结构域结构域拇指拇指手指手指手掌手掌dna dna 聚合酶聚合酶lthe specialization of dna pol

8、ymerasesl the mechanism of dna polymerasesubunits of dna polymerases the role of the subunitsmechanismthe specialization of dna polymerasessubunits of dna polymerases the role of the subunitsfunctionldna rapid processive synthesisldna 快速合成快速合成ldna accurate synthesisldna 精确合成精确合成dna pol 是延伸酶是延伸酶 l延伸能

9、力是酶作用在底物上的一种性质.ldna pol的延伸能力是酶每次与引物结合时加上的核苷酸数量. l一个位点可以催化加上的四种一个位点可以催化加上的四种 dntps中的任中的任何一种何一种. l识别不同的识别不同的 dntp 通过进入的通过进入的 dntp i形成形成 a-t 和和 g-c 碱基配对碱基配对; 不正确的碱基配对会不正确的碱基配对会大大降低催化效率大大降低催化效率 l通过空间位阻区分通过空间位阻区分rntp 和和 dntp ，将，将 rntps 排出活性位点排出活性位点.dna 精确合成精确合成通过空间位阻区分通过空间位阻区分rntp 和和 dntp ，将，将 rntps 排出排出

10、活性位点活性位点.核酸外切酶校对新合成的核酸外切酶校对新合成的dna偶然的碱基配对错误导致了 dntp不配对. (10-5 错误概率) 不匹配的dnmp 通过核酸外切酶被去除.复制后错配修复过程lthe chemistry of dna synthesisthe chemistry of dna synthesisldna polymerasedna polymeraselthe replication forkthe replication forklthe replication processthe replication process复制叉复制叉新合成的模板链和未复制的dna双链的交

11、界处 3.启动启动原因原因: 聚合酶校对活性聚合酶校对活性启动过程启动过程:1. 解开双螺旋解开双螺旋 dna 解旋酶解开了双链解旋酶解开了双链 dna的两条链的两条链 拓扑异构酶破坏了超螺旋结构拓扑异构酶破坏了超螺旋结构2. 半不连续半不连续前导链前导链:后随链后随链:冈崎片段冈崎片段:dna 解旋酶在复制前解开双螺旋解旋酶在复制前解开双螺旋六聚体蛋白六聚体蛋白 拓扑异构酶在复制叉处打开dna超螺旋结构 单链结合蛋白单链结合蛋白 (ssbs) 稳定单链稳定单链 dna 协同结合 与序列无关的结合方式 (静电相互作用) 3. primingreason: polymerase proofrea

12、ding activitypriming process:1. unwind the double helix dna helicases separate the two base-paired strands of dupiex dna topoisomerase removes supercoils 2. semi-discontinuouslyleading strand :lagging strand:okazaki fragment:dna 链增长的方式, ii. 将新合成的短链结合在一起。 通过连接酶缺陷的t4噬菌体感染大肠杆菌 kazunori sugimoto, tsunek

13、o okazaki, and reiji okazaki, proc. natl. acad. sci. u.s.a 1968 60: 1356-1362.半不连续复制的证据是由冈崎发现的半不连续复制的证据是由冈崎发现的 (1968)reiji okazaki was born near hiroshima, japan, in 1930. he was a teenager there at the time of the explosion of the first of two nuclear bombs that the us dropped at the end of world w

14、ar ii. his scientific career was cut short by his untimely death from cancer in 1975 at the age of 44, perhaps related to his exposure to the fallout of that blast.tsuneko okazaki, until recently, was a professor atthe university of nagoya where she was the first woman at that institution to be name

15、d a professor.currently she is on the faculty of medicine in fujita, and does research on centromeres.冈崎实验v这个实验清晰地证明了这个实验清晰地证明了1000-2000-核苷酸片段的核苷酸片段的 “冈崎片段冈崎片段”.v这些碎片在这些碎片在dna复制完成后加入正常的复制完成后加入正常的dna。v根据冈崎的实验提出根据冈崎的实验提出dna复制遵循复制遵循 “back and fill” 机理机理. e.coli t- 2, 7, 15, 60pulse-labeling in dt-h3 st

16、op in kcn 0stop in kcn 0d.s. dna s.s. dna density gradient of sucrose measure h3-t pulse-chase 20 in dt-h3 30 transfer to dt then transfer to dt then continuecontinueh3-t pulse-chase pulse-labeling 120 60 15 7 2 10s (1kb) 70s (prok. 400nt/sec) dna replication in okazaki fragment 1kb3. primingreason:

17、 polymerase proofreading activitypriming process:1. unwind the double helix dna helicases separate the two base-paired strands of dupiex dna topoisomerase removes supercoils 2. semi-discontinuouslyleading strand :lagging strand:okazaki fragment:合成一条新的合成一条新的 dna 链需要链需要 rna 引物引物 引发酶是一种专门的rna聚合酶，致力于为单链

18、dna模板制作的短rna引物。不需要特定的dna序列。 dna聚合酶可以按照dna模板延长rna和dna引物priming of dna synthesisrna 引物必须在引物必须在 dna 复制之后被移复制之后被移除除核糖核酸酶h，dna聚合酶和dna连接酶共同发挥作用3. primingreason: polymerase proofreading activitypriming process:1. unwind the double helix dna helicases separate the two base-paired strands of dupiex dna topoi

19、somerase removes supercoils 2. semi-discontinuouslyleading strand :lagging strand:okazaki fragment:the chemistry of dna synthesisthe chemistry of dna synthesisdna polymerasedna polymerasethe replication forkthe replication forkthe replication processthe replication processchapter 8 the replication o

20、f dna复制过程复制过程l起始l增长l终止l复制起始复制起始l dna解旋和开始复制的位置解旋和开始复制的位置.l复制起始的模型复制起始的模型复制器复制器起始子起始子ldna复制的起始复制的起始l在大肠杆菌中在大肠杆菌中l在真核细胞中在真核细胞中复制起始的复制子模型复制起始的复制子模型3/18/05 由由 jacob 和和 brenner in 1963提出提出 所有的所有的dna 都来自一个独特的起点：复都来自一个独特的起点：复制子制子 复制起始的两种控制物：复制器和起始复制起始的两种控制物：复制器和起始子子起始子起始子: 特异性地识别复制器中特异性地识别复制器中的一个的一个dna元件并激

21、活复制的元件并激活复制的起始起始复制器复制器: 足够指导足够指导dna复制起始的复制起始的整套顺式作用的整套顺式作用的dna序列序列复制器序列复制器序列3/18/05oric in e. coli chromosomal dna起始子蛋白的三种功能起始子蛋白的三种功能:1. 结合到复制器结合到复制器, 2. 弯曲弯曲/解开解开 一个一个 dna序列序列,3. 与其他复制因子相互作用并引起它们起作用与其他复制因子相互作用并引起它们起作用dnaa in e. coli (all 3 functions), origin recognition complex (orc) in eukaryotes

22、 (functions 1 & 3)initiation of dna replication in e. coliinitiation in e. colilorigins of replicationlthe sites at which dna unwinding and initiation of replication occur.lthe replicon model of replication initiationreplicatorinitiatorlinitiation of dna replicationlin e. colilin eukaryote复制前复合物

23、pre-rc activation & assembly of the replication fork in eukaryotes前复制复合体（pre-rcs） 由两种蛋白激酶激活 (cdk and ddk) 这两种蛋白只有在细胞进入s期时才被激活.起始位点的激活起始位点的激活:pre-rc 在每个细胞周期中只能被形成在每个细胞周期中只能被形成和调控来调节一轮的复制和调控来调节一轮的复制.only one opportunity for pre-rcs to form, and only one opportunity for pre-rc activation.复制起始的调节复制起始的调节figure 8-31 effect of cdk activity on pre-rc formation and activationcell cycle regulation of cdk activity and pre-rc formatinthe replication processlinitiationlelongation ltermination在复制中，同时合成前导链和后随链。在复制中，同时合成前导链和后随链。为了协