第二章酶制剂发酵生产

1、第二章第二章 酶制剂发酵生产技术酶制剂发酵生产技术v酶合成方式：酶合成方式： 1958 Crick 1958 Crick 中心法则中心法则 DNAmRNA酶酶转录转录翻译翻译RNA聚合酶聚合酶第一节第一节 酶生物合成调控机制酶生物合成调控机制u转录是以转录是以DNADNA为模板，以核苷三磷酸为底物，为模板，以核苷三磷酸为底物，在在RNARNA聚合酶（转录酶）的作用下，生成聚合酶（转录酶）的作用下，生成RNARNA的过程。的过程。u翻译：以翻译：以mRNAmRNA为模板，以氨基酸为底物，在为模板，以氨基酸为底物，在核糖体上通过各种核糖体上通过各种tRNAtRNA，酶和辅助因子的作酶和辅助因子的作

2、用，合成多肽的过程。用，合成多肽的过程。一、诱导作用（一、诱导作用（InductionInduction） 1 1、概念：、概念： 某些酶在通常情况下生物体不能合成或合某些酶在通常情况下生物体不能合成或合成很少，但加入成很少，但加入“诱导物诱导物”后，就能大量后，就能大量合成，这种现象称为诱导。合成，这种现象称为诱导。 Lac z Lac y Lac aLac z Lac y Lac a 2020世纪世纪6060年代初年代初 法国法国 巴斯德研究所巴斯德研究所F. Jacob and J. MonodF. Jacob and J. Monod“乳糖操纵子假说乳糖操纵子假说”乳糖酶乳糖酶（1 1

3、）决定酶合成有两个不同的基因群。）决定酶合成有两个不同的基因群。2 2、乳糖操纵子假说、乳糖操纵子假说决定酶合成的决定酶合成的两个基因群两个基因群操纵子操纵子（operon）调节基因调节基因R(Regulatory gene)启动基因启动基因P 操纵基因操纵基因O结构基因结构基因SP: PromotorO: OperatorS: StructureSPLac zLac yLac aOR调节调节基因基因操纵操纵基因基因启动启动基因基因结构结构基因基因OperonOperon操纵子操纵子DNA 调节基因（调节基因（Regulatory gene）： 可产生阻遏蛋白，阻遏蛋白能与操纵基因可产生阻遏蛋

4、白，阻遏蛋白能与操纵基因结合。结合。R阻遏蛋白阻遏蛋白SPLac zLac yLac aORDNA 启动基因（启动基因（Promotor）：）： 是是RNARNA聚合酶的结合部位和转录起点。聚合酶的结合部位和转录起点。 RNA RNA聚合酶聚合酶SPLac zLac yLac aORDNA 结构基因（结构基因（StructureStructure）：）： 是是DNADNA模板，在模板，在RNARNA聚合酶作用下，根据其碱聚合酶作用下，根据其碱基序列转录出基序列转录出mRNAmRNA。SPLac zLac yLac aORDNAmRNA zmRNA ymRNA a转录转录翻译翻译酶酶 RNA R

5、NA聚合酶聚合酶 操纵基因（操纵基因（Operator）：）： 位于启动基因和结构基因之间的一段碱基位于启动基因和结构基因之间的一段碱基序列，是阻遏蛋白的结合位点。在操纵子中序列，是阻遏蛋白的结合位点。在操纵子中起起“开关开关”作用。作用。SPLac zLac yLac aORDNA调节调节基因基因操纵操纵基因基因SPLac zLac yLac a 阻遏蛋白（阻遏蛋白（有活性）有活性）转录转录启动启动基因基因ORA A、无诱导物（乳糖）存在、无诱导物（乳糖）存在结构基因结构基因RNARNA聚合酶聚合酶翻译翻译酶酶mRNA（2）乳糖酶合成调控方式）乳糖酶合成调控方式mRNAZmRNAYmRNAA

6、 阻遏蛋白阻遏蛋白(无活性无活性) 乳糖乳糖 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)调节调节基因基因操纵操纵基因基因SPLac zLac yLac a启动启动基因基因R结构基因结构基因RNARNA聚合酶聚合酶B B、有诱导物（乳糖）存在、有诱导物（乳糖）存在O转录转录翻译翻译酶酶Question： 以上理论对指导酶制剂以上理论对指导酶制剂生产有何实际意义？生产有何实际意义？3 3、乳糖操纵子假说对指导、乳糖操纵子假说对指导酶制剂生产的意义酶制剂生产的意义在酶合成时添加在酶合成时添加诱导物诱导物底物底物关键：选择合适的诱导物和其浓度关键：选择合适的诱导物和其浓度底物的底物的结构类似物结构类似物实验确定

7、实验确定生产实例：酵母生产生产实例：酵母生产- - 半乳糖苷酶半乳糖苷酶以以葡萄糖葡萄糖作唯一碳源作唯一碳源培养酵母菌培养酵母菌以以乳糖乳糖作为唯一碳源作为唯一碳源培养酵母菌培养酵母菌几分钟后几分钟后-半乳半乳糖苷酶糖苷酶乳糖最佳诱导浓度：乳糖最佳诱导浓度：120g/L120g/L意义意义2 2：利用现代诱变育种技术：利用现代诱变育种技术 使基因发生突变使基因发生突变 使调节基因使调节基因R发生突变发生突变 使操纵基因使操纵基因O发生突变发生突变mRNAzmRNAymRNAa转录转录翻译翻译酶酶RNARNA聚合酶聚合酶R 调节基因调节基因R突变突变 利用现代育种技术，使调节基因发生突变，致利用

8、现代育种技术，使调节基因发生突变，致使其不能产生阻遏蛋白，使诱导酶变成组成酶。使其不能产生阻遏蛋白，使诱导酶变成组成酶。 阻遏蛋白阻遏蛋白PLac zLac yLac aOSmRNAZmRNAYmRNAa转录转录翻译翻译酶酶RNARNA聚合酶聚合酶 操纵基因操纵基因O突变突变 利用现代育种技术，使操纵基因发生突变，使利用现代育种技术，使操纵基因发生突变，使其不与阻遏蛋白作用，使诱导酶变成组成酶。其不与阻遏蛋白作用，使诱导酶变成组成酶。 阻遏蛋白阻遏蛋白(有活性有活性)PLac zLac yLac aRSO二、酶合成的反馈阻遏二、酶合成的反馈阻遏 Repressionv反馈阻遏是指酶作用的终产物

9、对酶合成反馈阻遏是指酶作用的终产物对酶合成产生阻遏作用产生阻遏作用 阻遏蛋白阻遏蛋白操纵基因操纵基因结构基因结构基因调节基因调节基因mRNA酶蛋白酶蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。不能与操纵基因结合，所以结构基因表达。酶代谢产物一旦大量积累酶代谢产物一旦大量积累v这一理论在实践意义：这一理论在实践意义：(1)(1)设法从培养基中除去其终产物，以消除反设法从培养基中除去其终产物，以消除反馈阻遏。馈阻遏。三、酶合成的分解代谢阻遏作用三、酶合成的分解代谢阻遏作用v又称葡萄糖效应又称葡萄糖效应 是指微生物在其培养基中由于葡萄糖的存在是指微生物在其培养基中由于葡萄糖的存在虽然能

10、迅速生长，但明显地抑制某些分解代虽然能迅速生长，但明显地抑制某些分解代谢诱导酶的形成。谢诱导酶的形成。 将将E.coliE.coli培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基培养在含有葡萄糖和乳糖的培养基上，出现上，出现“二峰生长现象二峰生长现象” 即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗尽之后诱即使有乳糖存在，也要等葡萄糖耗尽之后诱导形成导形成 - -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 葡萄糖分解产物对葡萄糖分解产物对 - -半乳糖苷酶形成阻遏半乳糖苷酶形成阻遏葡萄糖过量存在葡萄糖过量存在放出的能量部分储存在放出的能量部分储存在ATPATP中中ADP+AMP ADP+AMP ATP ATP cAMP +H2O AMP cAMP

11、 +H2O AMP cAMP-CRPcAMP-CRP复合物的浓度降低复合物的浓度降低启动基因启动基因(P)(P)上没有上没有cAMP-CRPcAMP-CRP复合物结合复合物结合RNARNA聚合酶无法结合到启动基因聚合酶无法结合到启动基因酶的生物合成无法进行。酶的生物合成无法进行。磷酸二酯酶磷酸二酯酶酶酶微生物微生物引起阻遏作用物质引起阻遏作用物质-淀粉酶淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌果糖果糖纤维素酶纤维素酶绿色木霉绿色木霉葡萄糖、甘油、纤维二糖葡萄糖、甘油、纤维二糖蛋白酶蛋白酶巨大芽孢杆菌巨大芽孢杆菌葡萄糖葡萄糖淀粉葡萄糖苷酶淀粉葡萄糖苷酶二孢内孢酶二孢内孢酶麦芽糖、葡萄糖、甘油麦芽糖

12、、葡萄糖、甘油分解代谢阻遏实例分解代谢阻遏实例v用甘油代替果糖培养嗜热脂肪芽孢杆菌，用甘油代替果糖培养嗜热脂肪芽孢杆菌，- - 淀粉酶产量可提高淀粉酶产量可提高2525倍。倍。v采用甘露糖作为荧光假单胞杆菌培养基时，采用甘露糖作为荧光假单胞杆菌培养基时，纤维素酶的产量比用半乳糖作为培养基时要纤维素酶的产量比用半乳糖作为培养基时要高高15001500倍以上。倍以上。v如果微生物需要某些代谢阻遏物作为碳源，如果微生物需要某些代谢阻遏物作为碳源，在工业生产中则可采用限量流加碳源的办法，在工业生产中则可采用限量流加碳源的办法，便可减少或避免这种阻遏作用。便可减少或避免这种阻遏作用。第二节第二节 产酶微

13、生物的筛选产酶微生物的筛选 动物动物 酶酶 植物植物 微生物微生物微生物易于大量培养，倍增时间短；微生物易于大量培养，倍增时间短；DNADNA技术使微生物生产特殊作用的酶，并技术使微生物生产特殊作用的酶，并大大提高产量；大大提高产量；因此，微生物可以说是酶商业化生产的最佳来源。因此，微生物可以说是酶商业化生产的最佳来源。1 1、产酶菌的分布规律、产酶菌的分布规律为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可为获得能够降解某种物质的产酶菌株，一般可以从该物质比较丰富的地方寻找。以从该物质比较丰富的地方寻找。 Exp. Exp. 豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌；豆科植物的根系中，往往存在根瘤菌； 油田

14、和炼油厂周围土层中常见分解石油的微油田和炼油厂周围土层中常见分解石油的微生物；生物； 处理降解合成物质的产酶菌则往往能在污水处理降解合成物质的产酶菌则往往能在污水处理处获得；处理处获得；v生产性能鉴定主要通过生产性能鉴定主要通过初筛初筛和和复筛复筛确定。确定。v初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目初筛是从已分离出来的菌种中挑出能产生目标酶的菌株，要求检出方法快捷、简便标酶的菌株，要求检出方法快捷、简便v初筛多选用平板培养透明圈法初筛多选用平板培养透明圈法2 2、菌种生产性能鉴定、菌种生产性能鉴定v细胞外的水解酶细胞外的水解酶 1 1、溶解度、溶解度不溶性底物如淀粉、纤维素、酪素、不溶性底物如

15、淀粉、纤维素、酪素、细胞壁等培养基中生长细胞壁等培养基中生长透明圈大小透明圈大小 2 2、酸碱度、酸碱度酸碱指示剂酸碱指示剂变色圈大小和颜色变色圈大小和颜色3 3、颜色、颜色合成特定底物与酶反应变色合成特定底物与酶反应变色变色变色深浅深浅v复筛是在初筛的基础上筛选产酶量高，性能复筛是在初筛的基础上筛选产酶量高，性能更符合要求的菌株，要求测定方法准确可靠。更符合要求的菌株，要求测定方法准确可靠。v复筛多采用摇瓶培养的方法。将初筛出来的复筛多采用摇瓶培养的方法。将初筛出来的菌种移入三角瓶振荡培养，对产物进行分析菌种移入三角瓶振荡培养，对产物进行分析检定，找出产酶量最高，性能符合要求的菌检定，找出产

16、酶量最高，性能符合要求的菌株。株。第三节第三节 酶的液体深层发酵法酶的液体深层发酵法v液体深层发酵是现代普遍采用的方法，主要液体深层发酵是现代普遍采用的方法，主要设备发酵罐是一个具有搅拌浆和通气系统的设备发酵罐是一个具有搅拌浆和通气系统的密闭容器。国内多采用密闭容器。国内多采用10-50t，国外多用，国外多用100t以上。以上。液体发酵流程图实验室种子制备阶段（一级种子培养）生产车间种子制备阶段（二级种子培养、 三级种子培养）二级发酵 三级发酵沙土孢子冷冻干燥孢子斜面孢子摇瓶液体培养固体培养基培养一级种子罐二级种子罐发酵罐空气空气空气净化处理空气净化处理保藏菌种保藏菌种斜面活化斜面活化扩大培养

17、扩大培养种子罐种子罐主发酵主发酵碳源、氮源、无碳源、氮源、无机盐等营养物质机盐等营养物质灭菌灭菌 酶分离纯化酶分离纯化成品（液体或颗粒）成品（液体或颗粒）控制t、pH、DO、泡沫、补料等发酵罐发酵全过程动画.exe（1 1）温度的调节控制）温度的调节控制 Exp.Exp.不同的细胞有各自不同的最适生长不同的细胞有各自不同的最适生长温度。如：枯草杆菌最适生长温度温度。如：枯草杆菌最适生长温度34343737，黑曲霉，黑曲霉28283232，植物细胞，植物细胞2525左右。左右。v温度控制的方法一般采用热水升温，冷水温度控制的方法一般采用热水升温，冷水降温，故此在发酵罐中，均设计有足够传降温，故此

18、在发酵罐中，均设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等。套、喷淋管等。（2 2）pHpH的变化与控制的变化与控制v培养基的培养基的pHpH值与细胞的生长繁殖以及发酵产值与细胞的生长繁殖以及发酵产酶都有密切关系。酶都有密切关系。 细胞发酵产酶的最适细胞发酵产酶的最适pHpH值通常接近于该酶反值通常接近于该酶反应的最适应的最适pHpH值。值。 例如：发酵生产碱性蛋白酶的最适例如：发酵生产碱性蛋白酶的最适pHpH值为碱值为碱性性(pH8.5(pH8.59.0)9.0)；而酸性；而酸性(pH4.0(pH4.06.0)6.0)条件条件有利于酸性蛋白

19、酶的产生。有利于酸性蛋白酶的产生。 v有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培有些细胞可以同时产生多种酶，通过控制培养基的养基的pHpH值，往往可以改变各种酶之间的产值，往往可以改变各种酶之间的产量比例。量比例。 Exp.Exp.黑曲霉可既生产黑曲霉可既生产-淀粉酶，又可生产糖淀粉酶，又可生产糖化酶。化酶。 pHpH值中性值中性-淀粉酶增加糖化酶减少；淀粉酶增加糖化酶减少； pHpH值酸性值酸性糖化酶增加糖化酶增加-淀粉酶减少。淀粉酶减少。vpHpH的调节可以通过改变培养基的组分或的调节可以通过改变培养基的组分或比例来实现，必要时可以使用缓冲溶液，比例来实现，必要时可以使用缓冲溶液，或流加适宜的

20、酸、碱溶液，以调控培养或流加适宜的酸、碱溶液，以调控培养基的基的pHpH变化。变化。（3 3）溶解氧的调节控制）溶解氧的调节控制 大多数的产酶菌是好气菌，调节通气量对产大多数的产酶菌是好气菌，调节通气量对产酶意义重大。酶意义重大。一般细胞只能利用溶解在培养基中的氧气一般细胞只能利用溶解在培养基中的氧气溶解氧。溶解氧。液体发酵较小的通气量有助于霉菌的生长，液体发酵较小的通气量有助于霉菌的生长，较大的通气量有助于产酶。较大的通气量有助于产酶。（4 4）泡沫形成与控制）泡沫形成与控制v泡沫是如何形成的？泡沫是如何形成的？ 通气通气, ,搅拌；搅拌； 发酵液中含有蛋白质、糖和脂肪等发酵液中含有蛋白质、

21、糖和脂肪等. .泡沫的危害有哪些泡沫的危害有哪些大量逃液大量逃液增加污菌机会增加污菌机会使部分菌体黏附在罐盖或罐壁上失去作用使部分菌体黏附在罐盖或罐壁上失去作用泡沫严重时还会影响通气搅拌的正常进行，泡沫严重时还会影响通气搅拌的正常进行，防碍菌的呼吸，导致防碍菌的呼吸，导致产量下降产量下降 机械消泡机械消泡v机械消泡是一种物理作用，它是靠机械强机械消泡是一种物理作用，它是靠机械强烈振动和压力的变化，促使气泡破裂，或烈振动和压力的变化，促使气泡破裂，或借助于机械力将排出气体中的液体加以分借助于机械力将排出气体中的液体加以分离回收，从而达到消泡的作用。离回收，从而达到消泡的作用。v罐内消泡罐内消泡耙

22、式消泡桨耙式消泡桨化学消泡化学消泡消泡剂消泡剂v天然油脂天然油脂 玉米油、米糠油、豆油、棉子油、菜子油玉米油、米糠油、豆油、棉子油、菜子油和鱼油、猪油等。和鱼油、猪油等。 已有逐渐被合成消沫剂取代的趋势。已有逐渐被合成消沫剂取代的趋势。v高碳醇和酯类高碳醇和酯类 十八醇十八醇v聚醚类聚醚类 聚氧丙稀甘油和聚乙烯氧丙稀甘油（泡敌）聚氧丙稀甘油和聚乙烯氧丙稀甘油（泡敌）v硅酮类硅酮类 聚二甲基硅氧烷与其衍生物。聚二甲基硅氧烷与其衍生物。 （6 6）空气灭菌）空气灭菌v介质过滤除菌介质过滤除菌 让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物，而去的无菌空气的方法，

23、目前工业微生物，而去的无菌空气的方法，目前工业除菌几乎均采用该方法。除菌几乎均采用该方法。 常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维常用的过滤介质有棉花、活性炭或玻璃纤维等。等。第四节第四节 提高酶产量的方法提高酶产量的方法一、通过条件控制提高酶产量一、通过条件控制提高酶产量1141141 1、添加诱导物、添加诱导物适用：诱导酶类，效果十分显著。适用：诱导酶类，效果十分显著。关键：选择诱导物及诱导浓度关键：选择诱导物及诱导浓度诱导物种类：底物类似物；底物或诱导物前体或衍诱导物种类：底物类似物；底物或诱导物前体或衍生物；生物；NOTICENOTICE：诱导与阻遏无明显界限，关键在于浓度选择诱导与阻

24、遏无明显界限，关键在于浓度选择诱导物浓度对酶诱导形成速率有一定影响。诱导物浓度对酶诱导形成速率有一定影响。诱导潜伏期诱导潜伏期2 2、降低阻遏物浓度、降低阻遏物浓度分解代谢引起：分解代谢引起：适宜的碳源种类很重要适宜的碳源种类很重要 Exp.Exp.甘露糖作为碳源生产纤维素酶比使用甘露糖作为碳源生产纤维素酶比使用半乳糖酶活力提高了半乳糖酶活力提高了15001500倍。倍。经济角度必须采用导致分解代谢的碳源经济角度必须采用导致分解代谢的碳源限量添加或连续发酵限量添加或连续发酵 Exp. Exp. 采用限制葡萄糖的连续流加法发酵时，采用限制葡萄糖的连续流加法发酵时，大肠杆菌的大肠杆菌的半乳糖苷酶产率提高半乳糖苷酶产率提高6060倍。倍。二、其他提高酶产量的