Western Blot 原理和操作方法

1、Western Blot 原理和操作方法 工作原理蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等。其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1100g),分辨率高,可检出1091012mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。聚丙烯酰胺

2、凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis） 在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。 聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种 蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分

3、子形状的影响，而只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDSPAGE）。由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDSPAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。SDSPAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。本实验采用垂直板状不连续系统。所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。 PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差

4、异,而SDSPAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDSPAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮35分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS蛋白质复合物,SDS蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全

5、变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基。 样品处理液中通常加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子,可以自由通过凝胶孔径,所以它显示着电泳的前沿位置,当指示剂到达凝胶底部时,即可停止电泳。 另外样品处理液中也可加入适量的甘油或蔗糖以增大溶液密度,使加样时样品

6、溶液可以沉入样品加样槽底部。重要参数 聚丙烯酰胺凝胶(PAG)制备原则:由于孔径的大小取决于单体和双体丙烯酰胺在凝胶中的总浓度(T)以及双体占总浓度的百分含量即交联度(C)决定的,因而制胶之前必须首先知道这两个参数。一般可以由下述公式计算: T%=(a+b)/m×100%和 C%=a/(a+b)×100% 其中: a=双体(bis)的重量 ;b=单体(arc)的重量 ;m=溶液的体积(ml) 当分析一个未知样品时,常常先用7.5%的标准凝胶制成410的梯度凝胶进行试验,以便选择理想的胶浓度。如果蛋白质的分子量已知,可参考下表选择所需凝胶浓度: 蛋白质分子量范围(Da) 适宜

7、的凝胶浓度(%) <104 2030% 1×1044×104 1520 % 4×1041×105 1015% 1×1055×105 510% >5×105 25 % 蛋白质的样品制备： 蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：1：在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 2：选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。 3：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分

8、子。 4：防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（建议加入合适的蛋白酶抑制剂） 5：样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或直接以液体状态置80中保存，但要注意不要反复冻融。 一、准备工作： 一个水浴箱，一台超声装置，组织匀浆器 二、需要的溶液： 裂解液 Laemmli样品缓冲液三、操作步骤： 1)培养细胞蛋白质样品的制备： 1：胰酶酶解后裂解： 细胞培养至80%左右密度时，以含0.05%胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在离心管中，加入450l裂解液反复吹打。 2：皿上直接裂解： 细胞培养至80%左右密度时，细胞经预

9、冷的PBS漂洗3次，加入450l裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至离心管中，反复吹打。 以上所得的样品最终用超声细胞破碎仪超声处理，超声时为5S，间歇时间为10S，功率为100120W至溶液清澈无粘稠为止，处理过程在水浴中进行，后425000g离心1小时取上清或以最大强度超声4次，每次1530S，在每次超声步骤之间将样品转置水浴中15S，加入Laemmli 样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合），强力混匀，样品置100水浴箱里水浴加热35分钟，10000g离心10分钟，取出清液，将其移入另一洁净试管中，至此，电泳样品已准备就绪。（样品可立即使用也可以分装冻存，20存放的样品

10、可稳定保持数月） 2)组织样品的制备：手术切除的组织块迅速置于预冷的0.95生理盐水中，漂洗数次，以清洁表面的血迹，将组织称量后切成几个较小的组织块放入机戒组织匀浆器中，按组织净重，裂解液或PBS=1：10的比例，加入相应体积的裂解液进行匀浆，离心收集上清（如有粘稠物可超声处理，具体方法见细胞培养的样品制备，也可以冷冻干燥降解核酸后，将冻干的蛋白质样品溶解在适当的上样 buffer中，混匀后静置3小时使样品中的蛋白质充分的溶解，有5分钟即可，4度离心收集。）加入Laemmli样品缓冲液（视蛋白样品浓度，以1：1或1：2的比例混合）强力混匀，样品置100度的水浴箱水浴加热35分钟，10000g离

11、心10分钟，取上清液，将其转入另一洁净的试管中，至此，电泳样品已准备就绪（样品即可立即使用也可也可以分装冻存，20存放的样品可稳定保持数月。亚细胞组分分离方法：（参考）离心 时间 亚细胞组分1,000g ×10 min pellets nuclei（细胞核） heavy mitochondria（线立体） plasma membrane sheets（浆膜）3,000g×10 min heavy mitochondria（线立体） plasma membrane fragments（浆膜）6,000g×10 min Mitochondria（线立体） Lysoso

12、mes（溶酶体） Peroxisomes（过氧化物酶体） intact Golgi（完整高尔基体）10,000g×10 min Mitochondria（线立体） Lysosomes（溶酶体） Peroxisomes（过氧化物酶体） intact Golgi membranes（完整高尔基体膜）20,000g×10 min Lysosomes（溶酶体） Peroxisomes（过氧化物酶体） Golgi membranes（高尔基体膜） large dense vesicles（大高密度囊泡）100,000g×10 min all vesicles from ER

13、（来自内质望网的囊泡） plasma membrane（浆膜） Golgi（高尔基体） Endosomes（内含体）附： 一：裂解液的制备： 组织裂解液（全细胞蛋提取）：1：TrisHCL 50mmoL/L PH 7。4 2: Nacl 150 mmoL/L 3: 去氧胆酸钠 0.25% 4：NP40或Tritonx100 1% 5: EDTA 1 mmoL/L 6： PMSF 1 mmoL/L7： Aprotinin 1g/ml 8: leupeptin 1g/ml 9: pepstain 1g/ml 其中:7,8,9作用不持久，要使用前加入。 细胞裂解液：1：NP40裂解体系：150 mm

14、oL/L Nacl 1。0%NP40或Tritonx100 50 mmoL/L Tris(PH8。0) 2：RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl 1。0%NP40或Tritonx100 0.5%脱氧胆酸钠 0.1%SDS 50 mmoL/L Tris( ph8。0) 二：Laemmli 样品缓冲液配置（1×SDS样品缓冲液） 50 mmoL/L TrisHCL （PH8。0） 100 mmoL/L DTT 2% SDS 0.1% 溴酚蓝 10% 甘油 此液可以配置成不同的储存液，根据蛋白浓度而定，40C长期保存，用时临时与蛋白液按比例混合，其中DTT应临时加入，以防降解。

15、 蛋白质定量 1)Bradford法: 检测原理: Bradford与蛋白质四级结构,特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,595nm检测。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶,去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX100,SDS,NP40等。 Bradford法浓染液的配制:将100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml浓磷酸;然后,用蒸馏水补充至200ml;此染液放4至少6个月保持稳定。 标准曲线蛋白质样本的制备:尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品,例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准,如

16、果待测样品是未知的,也可用抗体作为标准蛋白,通常在20g 150g/100l之间绘制标准曲线。 将待测样本溶于100l缓冲溶液中,该缓冲溶液相同(最好用PBS) 按照1:5用水稀释浓燃料结合溶液,如果出现沉淀,过滤除去。 每个样品家5ml稀释的燃料结合溶液,作用530分钟,燃料与蛋白结合,将由红色变为兰色,在595nm波长下测定其吸光度,注意显色反应不超过30分钟。 根据标准曲线计算待测样品的浓度。 2)Lowry法: 检测原理: 是Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成兰色络合物,菲林试剂增强兰色形成,750nm检测。 首先,将20g碳酸钠溶于500ml水中;再将1g CuSO4。5

17、H2O和2g酒石酸钠溶于500ml蒸馏水中;将铜/酒石酸钠溶液放在磁力搅拌器上搅拌缓缓加碳酸钠溶液,储存于冰箱中,可稳定保存1年以上。 Folinciocalteu酚试剂 按体积比1:2:1将铜/酒石酸/碳酸钠,5%SDS和0.8mmol/l NaOH溶液混合,室温下储藏,可稳定保存2周,标明为试剂 按体积比1:5将Folinciocalteu酚试剂和H2O混合,室温下储存于琥珀色试剂瓶中,可稳定保存1个月,表明为时机B用蒸馏水将样本(5100g)稀释为1ml,并准备100,50,25,12。5g /ml,4个浓度的BSA作为标准蛋白。 每个蛋白样品家1。0ml试剂A,混合均匀,在室温下孵育1

18、0分钟。 加入0.5 ml试剂B并立即混合, 在室温下孵育30分钟。 在750nm光波长下测定吸光度;根据标准曲线计算样本蛋白质的浓度。 3)紫外分光光度法: 检测原理:是因蛋白质样品在280nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在。 纯化蛋白质浓度的测定:在280nm波长下读取与适当对照相比较的吸光值。 对于抗体和BSA,可按照下述标准计算其浓度,对其他蛋白质粗略地估计:1单位吸光值相当于1mg/ml 蛋白质 A280(1mg/ml) IgG 1.35 IgM 1.2 BSA 0.7 含有核苷酸的蛋白质溶液浓度的测定: 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.55×

19、A280)(0.76×A260)蛋白质浓度(mg/ml)=A205(27+120A280/A205) 配胶、封胶注意一定要将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.70.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1

20、000，浓缩胶用0.8：1000）即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到分子克隆建议浓度。 灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时可用0.1%的SDS封，浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形

21、，可用适当粗细的针头拨正；若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。(10%的AP最好现配现用，如在4存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉.)制胶:制胶关键是聚合时间,最好是分离胶聚合控制在分离胶从加入10%AP和TEMED起至开始出现凝胶的时间为1520分钟（并不是此时已凝聚完全）。对浓缩胶最佳聚合速度为810min开始可见聚合，可以通过调节AP和TEMED的加入量来控制，因液体中含有分子氧可抑制凝胶的聚合，故用时可在真空中抽气以排除液体中的分子氧，灌完分离胶后加水以

22、封闭分离胶与外界氧气的结合，总之，要掌握一个原则：即用尽量少的催化剂在最佳时间聚合。 按比例配制分离胶，轻缓地摇动溶液（810下），使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水或正丁醇，以阻止氧气进入凝胶溶液中，然后静置90min。同前按比例配制浓缩胶，但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，以连续平稳的液流注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制90min以上以保证完全聚合。 5)预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入上下槽电泳缓冲液后低电压短时间的预电泳（恒压1020V,2030m

23、in），清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通。 6)加样： 预电泳后依次加入标准品和待分析样品，注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 7)电泳：加样完毕，盖好电泳槽的盖子并选择适当的电压进行电泳，通常在连续系统中，上层浓缩胶的电泳电压要低于分离胶的电泳电压，使样品更好的进入凝胶，电泳时，应采用恒压的模式，这样蛋白质才可以保证恒定的电泳迁移率。一般采用恒压浓缩胶80V，分离胶120V，电泳直至溴酚染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳。注意事项及常遇到的问题：1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

24、2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、AP用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀。5）电泳中常出现的一些现象： 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。拖尾：样品溶解不好。纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性

25、颗粒。条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。条带两边扩散：加样量过多。8)染色和脱色 电泳完毕需通过染色和脱色评定其结果的优劣。对凝胶中分离成不同条带的蛋白进行检测。此外,根据不同的研究目的,也可将凝胶电印迹 考马斯亮蓝染色: 将凝胶取出放入培养皿中到如少量的染色液,以浸没凝胶为宜,在摇床上震荡,直到凝胶上出现明显的条带为止,一般56小时或者4过夜;然后倾去染色液，用脱色液洗涤震荡,其间要不断换脱色液,直至脱色液颜色稍清亮。,凝胶背景清楚为止。 染色液配制: 90ml甲醇和H2O混合溶液(甲醇:水=1:1,V/V)和10ml冰乙酸的混合溶液中溶解0.25g考马斯亮蓝R250用滤纸过滤染液以除去

26、颗粒不溶性物质。 脱色液的配制: 90mL(甲醇):H20(1:1 V/V)和10ml冰乙酸溶液。 附： 一、蛋白标准品的选择 凝胶电泳中一个关键的指示系统，即蛋白标准品（Molecular Weight Marker），电泳的分离效率，转膜效率以及电泳泳动情况等，皆需通过蛋白标准品来显示，目前普遍采用的几种蛋白标准品有： Blue RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix Trichrom RangerTM prestained protein Molecular Weight Marker Mix 在电泳凝胶中随着蛋白质

27、的迁移，各种分子质量的标准蛋白逐渐分开，而显示出非常漂亮的多色条带，可通过电泳槽直接肉眼观察各电泳带的凝胶中的泳动情况，当相对于目的蛋白大小的标准蛋白与相邻两条标准蛋白达到所需分辨距离时，即可停止电泳，取出凝胶做进一步的转膜工作。 二、对照的设置 一般需要设立: 内参照,提示系统的稳定性,一般是一些管家蛋白 阳性对照, 即肯定可以表达你的目的蛋白的组织或者细胞,同时可以提示你一抗的质量阴性对照: 即肯定不会表达你的目的蛋白的组织或者细胞。在实验中根据你的需要选择蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDSPAGE后,分离为不同条带,其中含有能与特异性抗体(或McAb)相应的待检测的蛋白质(抗原蛋白)

28、,将PAGE胶上的蛋白条带转移到NC膜上此过程称为blotting,以利于随后的检测能够的进行,随后,将NC膜与抗血清一起孵育,使第一抗体与待检的抗原决定簇结合(特异大蛋白条带),再与酶标的第二抗体反应,即检测样品的待测抗原并可对其定量。电印迹 蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物具有牢固结合蛋白又不影响蛋白质Ag活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性等特点，常用的支持物有：硝酸纤维膜（NC膜）或PVDF膜。 蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式。 一半干式电转印 1Tris/甘氨酸SDSPAGE结束后，取出凝胶，在Tri

29、s/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取凝胶方法：用刀片将两玻璃板分开，将多余的凝胶划去，上部以浓缩胶为准全部弃去，下部以分子量标准最小分子带下一点全部划去，取一个10ml注射器注满转印缓冲液，插入玻璃板与凝胶之间注水，使水的压力将两者自然分开,边推边进,反复多次注水,直至凝胶从玻璃板上滑落下来。 2将NC膜和滤纸切出与凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润510min。 3按照以下顺序放置滤纸，凝胶和NC膜到半干槽中。 4每层之间的气泡要全部去除。可以用10ml吸管轻轻在上一层滚动去除气泡，然后用一绝缘的塑料片中间挖空与凝胶一样大小或略小一点，以防电流直接从没有凝胶处通过造成短路，盖好加上阳极电极板。 湿式

30、电转印 1Tris/甘氨酸SDSPAGE结束后，取出凝胶，在Tris/甘氨酸缓冲液中漂洗数秒。取出凝胶方法同半干式电转印。2打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转印液浸泡透的海面垫，再各放一块转印液浸透的滤纸，滤纸与海面垫大小相同或与NC膜，凝胶大小相同均可，将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将NC膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹。 3电泳槽加满电转印液，插入电转印夹，将电泳槽放入冰箱内（电转印液之前要放入冰箱内预冷），连接好电极，接通电流，转印夹的NC膜应对电泳槽的正极。 印迹膜上总蛋白的染色 在确定印迹中是否存在总蛋白之前,通过对硝酸纤维素膜染色可以了解转印至膜上的总蛋白质的组成情况,并可

31、确定蛋白质分子质量标记物的位置和确定转印成功,同时,该方法也清楚地显示出转印蛋白质的复杂性。 丽春红S印迹膜染色法： 丽春红S适用于酸性水溶液,染色但是不持久,在后续的处理中红色染料易被洗去,由于与蛋白质的结合是可逆性的,该染色方法适用于所有显示抗原的饿技术, 丽春红S带负电荷,可以与带正电贺的氨基酸残基结合,同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合,从而形成红色条带。 1)丽春红溶液的配制: 储存液(10×)： 0.1g丽春红溶于5ml冰乙酸,加入H2O定容至100ml,临用前稀释10倍为应用液。 2)操作步骤 转印结束后取出印迹膜至于丽春红S应用液中,并在室温下搅动510分钟 将膜

32、放入PBS洗数次,每次12分钟,并且更换PBS 根据需要将转印部位和分子量标准位置进行标记 选择最合适的蛋白杂交膜根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。硝酸纤维素膜： 硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一 起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合 的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择

33、不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是 膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45m和0.2m两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用 0.45m的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2m的膜了，如果用0.45m的膜就会发生“Blowthrogh”的现象。从膜的质地上来看，最 重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维 素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大

34、的蛋白结合量，可达80-150g/cm2。由于 100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜 比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。PVDF转移膜：PVDF 是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸 纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然 PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与

35、硝酸纤维素膜一样，可以进 行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检 测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。离子交换型转移膜： 硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的 DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE 基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的p

36、H环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种 0.45m孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合研究。还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。膜的封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止免疫试剂的非特异性吸附。封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，常用的有0.2%Tween-20，20%BSA，10%马血清以及5% No-fat milk等，至于选择哪一

37、类封闭液，首先应考虑与检测试剂相适应，如采用葡萄球蛋白A（SPA）作用检测试剂，就不能用全血清封闭，其次是尽可能使非特异着色背静浅，封闭液以20%BSA效果较好。 注意事项: 1.免疫印迹杂交的敏感与检测系统有关。因此,凝胶电泳时的蛋白上样量应该保证被检测抗原量不至于太低,如果过低应该重新纯化和浓缩使用,或者建议做一次梯度稀释,上样电泳后,直接考马斯亮蓝染色选择最佳上样量,纯化和浓缩的蛋白质样品必须注意盐的浓度过高,可平衡一下盐的浓度,如,透析。 2.形成凝胶的试剂要有足够的纯度,激活剂的浓度适当,不仅可以决定凝胶聚合的速度,也将影响凝胶的质量,聚胶时的温度也将影响凝胶聚合的速度。因此,建议要

38、根据不同温度下适量增减激活剂的用量以保证分离胶从加入激活剂起至开始出现凝胶凝聚的时间为1520分钟最佳,对于浓缩胶最佳聚合时间为810分钟开始可见聚合。灌完分离胶加水封闭分离胶与外界氧气的结合。 3.未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内。 4.电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气和未聚合的丙烯酰胺,同时建议低电压短时间的预电泳,清除凝胶内的杂质,疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通(恒压10

39、20V,2030min) 。 5.加样前样品应先离心,尤其是长时间放置的样品,以减少蛋白质带的拖尾现象。6.为避免边缘效应,可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液。 7.样品缓冲液中煮沸的样品可在20存放数,但是反复冻融会使蛋白质降解。 8.为减少蛋白质条带的扩散,上样后应尽快进行电泳,电泳结束后也应直接或者转印。 9.上样时,小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。 10.取出凝胶后应注意分清上下,可用刀片切去凝胶的一角作为标记(如左上角)转膜时也应用同样的方法对NC膜做上标记(如左上角)以分清正反面和上下关系。 11.转膜时应依次放好NC膜与凝胶所对应的电极,即凝胶对应负极,NC膜对应正极。We

40、stern Blot问题解答1.凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡5-10分钟，要含有20%的甲醇。2.条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极-海棉-滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。3.单个或多个白点转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液

41、要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗蛋白转膜，降低转膜效率。4、转膜缓冲液过热缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。5背景过高1）封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。2）一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入TWEEN-20或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到

42、这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。5) 曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间，或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带，那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。6、没有信号：1)用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20的作用就显现

43、出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。2)确信你的蛋白表达。3)确信蛋白高效的转移到你的膜上。4)一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始，以排除抗体的因素。5)ECL试剂盒质量的问题，不可小觑！8、关于SDS蛋白电泳的心得 1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验中采用90/120，后来改用了80并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样

44、品分子量18000 Da，15%的分离胶）；3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重 怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染 ）。 9.分别用多大电流转膜1）一般跟你的分离胶的浓度有关；2）与你的转印系统型号有关；3）与目的蛋白的分子量有关；10.出现了多条带1)一抗、或二抗抗体浓度太高2)多克隆抗体本身的非特异性反应3)抗体的特异性不强4)蛋白异构体或降解！5)你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为

45、的造成目的条带浓度的变化。所以严格意义上说，内参事必须做的。11.转膜的时候，最下端的蛋白条带很清楚，可是上边都没有看见1)可能是时间不够，因为一般是分子量小的先转上去的，大的后转，看你的目的蛋白了，如小的话，最后不要太长时间 2)转膜的时间要根据你的目标蛋白大小和胶浓度而定。蛋白越大、胶浓度越高，时间就要越长。经验是：1218的胶、418kD的蛋白用100v衡压/350mA衡流7590min的条件都可以成功转膜3)主要是转膜时间不够，若想证明这个问题，可把原来的SDS-PAGE，做一下染色，看看大分子量的蛋白是否仍在胶上。另外，做western时，转膜并不是最复杂的，但无疑是很重要的，如果胶

46、上残存的目的蛋白过多，会使与抗体结合的蛋白负荷不足，而影响实验结果，因而要反复摸索转膜时的时间、电压/电泳，直到获得满意转膜效果。 12.胶为什么总是漏1） 每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其它附件，下次用之前，用75酒精擦拭玻璃和胶条，能有效防漏，且利于剥胶。2） 避免玻璃边缘（与胶条接触处）破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方3） 关键是找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐就行了4） 胶条一定要干，跑完电泳后，胶条就放在实验台上晾着。5） 下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话用保鲜膜垫在上面，也可以有效防止漏胶，或者反过来用6） 玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密

47、封，装好架子后，在玻璃底边上抹上一层薄薄的凡士林就好了，两边多点（容易从两边漏）这样就不会漏了，就算是用了很久的很多小缺口的玻璃都没有问题，然后转移到电泳槽的时候，去掉封条，把底上的凡士林擦干就OK了（注意，一定要擦干净，尤其是少量进入了两隔玻璃之间空腔的，赢伟凡士林不导电，会影响第2相的效果的7）可以在海绵垫下再垫一些纸，使得它与玻璃贴的更紧密。或者在玻璃底部用琼脂糖封上。8） 因为两块玻板没有放的完全对齐，底部不在同一个平面，所以封条封不严，重新对齐后就不漏了。以后每次只要在水平的桌面上仔细对齐两块玻板，再夹紧。用手感觉一下确定在同一平面上后，放到灌胶架并压在封条上，卡紧。注意两边均匀用力

48、，一般不会再漏。9） 先把两块玻片放在夹子上，不要加紧，放到架子上，使两块玻片的底部对齐，夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片，这样一般就不会漏胶了。但是如果你放了垫片再对齐玻片底部，或者在桌子上对其玻片底部然后放到架子上的话，经常会漏胶13.条带跑得比正常的窄？1）可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀2）是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3）可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因

49、，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带走的较慢，好像与你的预想不一致4）常见的原因是：每孔上样量不均匀，应确保每孔中上样量一致5）可能是系统的ph出了问题，有可能是你的电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液，更新缓冲液看看，看是否能成功14.为什么会有“微笑”和“倒微笑”这样的效果呢？1）"微笑"是因为你灌胶的时候冷却不均匀，中间部分冷却不好，导致凝胶中的分子有不同的迁移率所致。这种情况在较厚的凝胶以及垂直电泳时常常发生。“倒微笑“也称“皱眉“现象常常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的，特别是当凝胶和玻璃板组成的三明治底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象2）书

50、上说出现“微笑”是因为整个胶冷凝的不均匀，中间部分和两端受热不一样而致成了“倒微笑”可能是因为两端的胶凝的不好，加APS和TEMED后应该混合均匀。3）样品中盐浓度过高？点样量太多或每孔点样量不均匀？电泳电压不稳定或过高？15. 制胶时好多泡1）首先，玻璃板一定要洗干净，用洗洁净洗，冲干净后再用双蒸水冲一，晾干。配胶的时候沿管壁缓缓加入各个成分，混匀的时候用手轻轻摇匀，如果用枪吹打时要缓慢且不要打到头。2）配胶时混匀要轻，尽量不产生气泡，上胶时要快，枪也不打到底。加完分离胶后用双蒸水封，待其凝固。即使在上胶时液面上有气泡，加水后也会浮上来。分离胶凝好后，倒掉里面的水，用吸水纸吸干，再加浓缩胶，

51、迅速插梳子。3）倒胶的时候，用1ml的枪沿一侧缓缓加入，不要打到头，以免带入气泡！4）将胶在小烧杯里配好后，将电泳槽略微倾斜，将烧杯的嘴靠在玻璃边缘，直接倒进去，速度快 ，而且不容易产生气泡，不妨试试5）用双蒸水封时建议用200ul的枪加水，这样压力小，以免把胶冲起来！6）国产的只能是缓慢加样，别把气泡加进去。如果加进去了，小心把整个板在桌上敲敲可以让气泡浮上来。7）分离胶中的气泡与插梳子有关，垂直插容易产生气泡，且不容意排除。将梳子倾斜5-10度插入，即使产生气泡也可以也可以通过轻轻晃动梳子使气泡从一侧逸出。8)pinghw 还有一个制胶起泡泡的原因，就是配胶的液体全部在四度存放，室温制胶时

52、由于温差及凝胶聚合反应放热的关系，液体中微小的气泡在凝固的凝胶中也会放大成可见的较大的泡泡，这种情况在夏天室温较高时更容易出现。避免的方法是将制胶成分中除催化剂外的部分配置后放室温下静置一会儿，减小温差后再加入催化剂制胶。15.一些琐碎的细节，但却是实验中可能经常遇到的令人头痛的问题：1 ）安装好的制胶装置，最好先用配置电泳缓冲液的水加满检验一下是否漏水，检验确认不漏水的装置再用于制备凝胶。 确认不漏水后，倒出水，然后使其尽量流出，其实残留的一点水并不影响结果，而且还会使电泳好的凝胶容易剥落下来。 漏水的装置制作的凝胶尽管可以使用，但它会造成电泳时候电流的分流，不但影响电流的效率，而且还会使部

53、分加样孔的条带歪曲。2） 制胶时最好最后加入AP，这样可以避免偶然情况下不能马上灌胶而导致胶的聚合，确认所有的东西准备齐全了，再最后加入AP，混合均匀后马上灌胶。一定要使配胶的几种溶液混合均匀，这是制得性质均一的凝胶的前提。3）进口的AP可以很快使胶凝聚。所以，AP的用量最好比书上推荐的用量少点，这样可以使胶的溶液慢慢聚合，这更有利于形成均匀一致的凝胶。也不会使操作变得手忙脚乱。4） 有时候，梳子拉出以后，明明看不到加样孔中有凝胶，但是就是加不进去样品，这主要是由于梳子与较大的那块玻璃之间的缝隙中存留的制胶溶液凝聚后形成的很薄的一层凝胶造成的。由于很薄，当梳子拉出后，它就会和玻璃分离，刚好将加

54、样孔的口封住了，如果用20ul的加样器加样的话，这层凝胶很容易将样品堵在外面，只要将这层凝胶除去，就可以顺利加样了。如果用专门的微量进样器，不会存在这样的问题。5）薄膜原因可能是由于梳子和 slide的厚度不是十分一致，而这可能是无法避免的。除此之外，也有由于拔出梳子时候造成的堵塞现象，个人认为，这样的堵塞现象可以通过插入梳子时先用水（配置电泳缓冲液的水）湿润梳子的方法避免，这样还有利于形成整齐的加样孔。不管怎么做，一定要等胶完全聚合好了再拉出梳子。 如果孔的形状变化了，扭曲了，肯定会导致条带不一致，结果不好。将变性的和不变性蛋白同时加样，相同浓度的抗体反应后，不变性的条带也可见，但明显较弱。

55、其原因，查资料后认为蛋白的某些抗原性被其天然的结构所掩盖，通过蛋白变性可使其抗原表位暴露。而且，现在的抗体都是用细菌表达的某段融合蛋白并且变性后来诱导产生的血清，与体内真正的蛋白有区别的，因此需要通过煮沸来变性体内蛋白，暴露需要的抗原部位。SDS主要为统一不同蛋白的电荷，去除其对电泳迁移率的影响。一抗孵育：分别与相应的抗体（初次做建议按照试剂要求的最高浓度开始，别舍不得，否则没结果更难受），及内参照抗体（-actin抗体1:10 000，这蛋白抗体效价特别高，所以预实验做一下一般会有阳性结果，一旦没条带可以排除你的实验操作中的因素）于室温温育90min，4过夜，再次室温温育60min。抗体稀释

56、液为TBST（内含1%的BSA）（其实直接室温2h就够了，背景老是太高放4度过夜有时候对降低背景效果不错）。16.漂洗：室温下以TBST液在平缓摇动条件下漂洗3次以上，每次各5min。勤换液比延长漂洗时间更有效。显影定影完毕，要用自来水冲干净胶片，不划伤，晾干以后再收藏，很重要配胶准备：将玻璃板、梳子有清洁剂或稀酸泡洗，电泳装置用水冲洗并晾干，亦可用酒精棉球擦洗灌胶面晾干。无显色信号问题的原因分析：1裂解产物中抗原含量不足a. 抗原无表达或表达量过少b. 蛋白降解或上样量不足c. 裂解产物制备失误2制胶浓度比例不合适。3转膜不完全4一抗稀释浓度过大5二抗与一抗不匹配6显色系统灵敏度不足非特意性杂带出现的原因分析：1封闭或清洗不彻底2一抗浓度过高3蛋白降解4抗体与非特异性蛋白交叉反应5蛋白间聚集作用，形成二具体6转移膜使用不当7操作过程中转移膜干燥Western Blot为什么必须