本文采用鼠B16黑素细胞为受试细胞,以氢醌,熊果苷比较, …

1、2005年第八届国际日用化工学术研讨会论文ATB-2600-C体内体外美白祛斑功效研究Research on Skin Whitening Effect of ATB-2600-C北京大学医学部，北京耐确生化技术研究所，刘毅，100083国天津天狮集团有限公司日化部，吴巧玲，301700 要 本文主要论述ATB-2600-C体内体外的美白祛斑功效关键词 美白 黑色素 酪氨酸酶 黑色素细胞Abstract： To investigate the effect of ATB-2600-C on melanogensis in vitro an

2、d in vivo.Key words： Whitening Melanin Tyrosinase Melanocyte 在世界各地，尤其是在亚洲60的日本女性和75的中国女性，都希望自己的表皮肤色白里透红。一个人的肤色，与多种因素有关，如皮肤的折光性、毛细血管的分布、血液流量等，但最主要的是决定于皮肤内的色素物质。色素物质位于人体表皮基部的色素细胞（melanocyte, MC）上，在显微镜下观察，色素是一些细小的褐色颗粒。色素分布愈多愈密，则人体肤色就会愈深愈重；相反色素分布愈少愈稀，则人体肤色就会愈白愈淡。据统计，不同肤色人种的色素细胞量是不同的，在每1平方毫米内，白色人种的色素细胞约在

3、1000个以下，黄色人种则在1300个左右，而黑色人种则超过了1400个。 所以说，皮肤颜色最主要由表皮中黑色素细胞多少和黑色素合成（Melanogenesis）快慢所决定。黑色素（melanin,也译为黑素）是一种生物多聚体（biopolymers），没有固定的分子量，它广泛存在于动物和人的皮肤，眼睛和毛发中。黑色素合成发生在黑色素细胞中，这是来自神经脊的细胞。黑色素细胞合成黑色素的特定细胞器是黑素体（melanosome,MS），正常人表皮黑色素细胞既合成棕色素（eumelanin，也译为真黑色素，或优黑色）,也合成褐色素（pheomelanin，也译为红黄色素，或脱黑色素，）以皮肤色素为

4、例：成黑素细胞(melanoblast,MB)从胚胎起源地神经脊迁移到特定靶点主要分散在表皮基底层角质细胞（Keratinocyte, KC）之间和毛囊。表皮黑素细胞形态细长而且扁平，并向周围的KC间伸出细长的树状胞突，黑素细胞这种形态特征有助于黑素小体向周围KC转移，使黑素能均匀分布于表皮基底层上方，以保护基底层的生发细胞（germinative cells）免遭紫外线（UVR）的伤害。每一个MC通常与大约33-40个KC发生联系，共同组成表皮黑素单元（epidermal melanin unit, EMU），也就是说，一个MC产生黑色输送到其周围30-40个KC中，使皮肤产生颜色。尽管在人

5、皮肤不同区域MC密度差异很大，但细胞总数相对稳定，甚至在不同人种也是如此，平均密度为10002000MC/cm2皮肤，基本不受种族、年龄和躯体部位的影响。在一些哺乳动物，MC在真皮内也能发现。真皮MC与表皮MC不同，真皮MC不分泌色素颗粒，推测真皮黑素细胞在保护皮肤免遭UVR损伤中可能不起作用。但真皮黑素细胞通过干扰光线折射也可能影响皮肤颜色。黑色素细胞经过延伸形成树突，经树突顶部，提供成熟的黑素体，进入角质细胞(KC),进一步生成皮肤黑色素。黑素小体（MS）分四个阶段成长为黑色素：第一阶段黑素小体为圆形，直径约0.3m，酪氨酸酶活性强，沿细丝集中，小体内不含黑素。第二阶段黑素小体呈椭圆形，长

6、约0.5m，含有交替排列的纵形细丝，胞膜和细丝均有酶活性，有少量黑素沉积。第三阶段黑素小体中酪氨酸酶活性减弱，部分是通过非酶性的聚合作用显示黑素不断沉积。第四阶段黑素小体中酪氨酸酶活性消失，全部通过非酶性聚合作用形成黑素，并充满整个小体。人是环境的产物，人种肤色随环境而变化，从细胞水平来说，是随皮肤内部色素量的变化，而色素量的变化，又是对外界光照强烈程度长期适应的结果。可以说人体肤色是自然界在人体上打下的烙印。在地球上不同人种肤色的分布，人体色素深浅变化的趋势，基本是与阳光辐射强弱程度相对应的。色素多、肤色深的人多集中在阳光充足的地球赤道附近。随着地球纬度的推移，离赤道愈远，阳光愈弱，则人体的

7、肤色也就愈浅愈淡。在亚洲，南亚人的肤色比北亚人的肤色要深；在欧洲也是这样，南欧人的肤色比北欧人的肤色也要深。 目前认为除了黑素细胞以及EMU的结构和功能外，以下6个独立且关联的过程与皮肤着色（pigmentation）密切相关：1.成黑素细胞（MB）自神经嵴迁徙；2.MB分化成黑素细胞；3.黑素小体的形成；4.黑素合成；5.黑素颗粒自黑素细胞向角朊细胞转移；6.黑素颗粒在角朊细胞内降解。总之，黑色素的形成经过一系列复杂生理生化过程，目前研发美白祛斑化妆品，主要是通过抑制酪氨酸酶的活性，来减轻皮肤的色素沉着，达到美白祛斑的功效。本文采用鼠B16黑素细胞为受试细胞，以氢醌，熊果苷比较，研究ATB-

8、2600-C对黑色细胞的增殖效果，抑制酪氨酸酶活性，以及抑制黑色素生成量的影响相关性。并制成3.5的霜剂做了100例美白祛斑观察试验, 评价了其安全性和功效作用。第一部分(a) B16黑素细胞的培养: B16黑素细胞处于37，空气中含5CO2的环境中,以10下BS为培养液，每2天传代1次。 (b) 测定细胞酪氨酸酶活性:以左旋多巴为催化底物,采用Marlinez-Esparza等改良方法测定。经药物作用4d后，弃去上清液，用PH7.0的PBS洗涤3次，每次经1000r/m离心5min,每孔加1Troton X-100溶液90l，溶解细胞。再经37预温后每孔加入1左旋多巴10l，37孵育30mi

9、n,于475nm波长处测吸光度，以空白孔调零，在37下一小时内每隔10min读各孔吸光度A值。酪氨酸酶活性抑制率（1A各浓度平均吸光值/A对照组平均吸光值）×100(c) 测定黑素细胞增殖活性 : 将B16 黑素细胞以3×104密度置入在12孔板中, 第2天换液,分别加入不同浓度药液，对照组用0.05（v/v）DMSO处理，在孵化终点，采集细胞,以锥蓝染色，并用血球计数器计数（number of live cells was counted with a hemocytometer）。 黑素细胞增殖抑制率=(1N各浓度组计数/ N对照组值计数)×100 (d) 测

10、定黑色素含量: 黑色素含量测定采用Hosoi等改良方法。B16黑素细胞以1×105密度培养在6孔板中，经24h后换液，添加不同浓度的药物，72h后,经PBS洗涤两次，样品经空气干燥,溶于200l 1N NAOH (含1DMSO) 。经加热80至1h后冷却，选择475nm波长在酶联免疫检测仪上读取吸光度值。黑色素含量抑制率 1（药物孔吸光度值/药物孔细胞密度）/ (对照孔吸光度值 / 对照孔细胞密度)×100 （e）统计分析 全部数值均以X +S 表示。并采用SPSS医用统计软件进行单因素方差分析。 ATB-2600-C与氢醌、熊果苷对酪氨酸酶抑制率 药物浓度组别 0.10.

11、51.53.5ATB-2600-C26.538.656.089.5氢醌15.527.630.580.5熊果苷10.518.525.570.6 ATB-2600-C与氢醌、熊果苷对黑素细胞增殖抑制率 药物浓度 组别0.10.51.53.5ATB-2600-C8.530.850.585.5氢醌26.841.552.699.5熊果苷8.920.138.880.5ATB-2600-C与氢醌和熊果苷对黑素细胞合成的抑制率 药物浓度组别0.10.51.53.5ATB-2600-C15.533.560.888.9氢醌7.518.536.978.5熊果苷6.515.628.969.6 第二部分 人体试验，采用自我评估（self-assessment）。所用美白祛斑霜（主要活性成分3.5ATB-2600C, 0.5CY-1100）。对照组采用其基质。受试组80人；对照组20人，均为女性。 Human study:self-assessment 2 Weeks 4WeeksScale Wording ATB-2600-C Vehicle ATB-2600-C Vehicle+2 Lighter 20 0 48 0+1 slightly lighter 55 1 30 2 0 No change 5 19 2 18-1 slightly darker 0 0 0 0-2 Darker 0 0