聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨

1、聚乙二醇化重组人生长激素质控难点探讨李晶 中检院生化及基因工程药物室正文重组人生长激素(Recombinant human growth hormone, rhGH)是由大肠杆菌或酵母菌表达的一种重要的非糖基化蛋白质激素，由191个氨基酸残基组成，相对分子量为22,125，等电点为5.2。临床上，rhGH主要用于治疗因内源性hGH缺乏而导致的儿童侏儒症、成人生长激素缺乏症等1。由于其体内半衰期仅为0.52hr左右，故需要每天、长期注射才能发挥疗效，治疗周期往往为一年以上2。聚乙二醇（Polyethylene glycols, PEG）是一种毒性极低的线性大分子聚合物，具有水溶性和免疫惰性。蛋白

2、类药物经PEG修饰后，可延长半衰期，增加稳定性，同时降低免疫原性和抗原性3。2008年，第一个N端被枝杈型PEG修饰的rhGH进入临床试验4。虽然未发现严重不良反应且无抗PEG-rhGH的特异抗体产生，该产品却因为在二期临床试验中观察到注射部位出现皮下脂肪萎缩而被终止临床研究。目前，国内已有3家企业申报了3种PEG-rhGH注射液，其中一家企业已取得了临床批件。虽然PEG-rhGH是在已收载于中国药典2010年版的比较成熟的重组人生长激素基础上进行研发的，但是，其质量标准中各项目及限度的制定不应简单地照搬rhGH的标准，还应结合其自身独特的理化结构性质及生物学活性，着重考虑PEG有关的质控项目

3、。1996年，美国Genentech公司的Clark等人利用分子量为5kDa的聚乙二醇（PEG），对重组人生长激素进行了长效改构研究5。研究结果表明，偶联后的重组人生长激素随着PEG偶联数目的增多，其体内半衰期也相应延长，但其与受体结合的活性及体内刺激大鼠胫骨增殖的活性却随着偶联数目的增加而急剧下降。同时，rhGH上可发生PEG修饰的10个位点中，有4个位点处于rhGH与受体的结合部位，直接影响着rhGH的活性。因此，每个rhGH分子究竟结合了几个PEG？这些PEG究竟结合在rhGH的哪些位点上？与这两个问题密切相关的两个指标PEG对rhGH的平均修饰率与PEG在rhGH上的修饰位点就成为该类

4、产品的重要质控指标与质控难点。目前尚无国外产品的质量标准可供参考，国内企业与此相关的质控技术还有待于进一步完善。本文即从这两个质控关键技术进行讨论，并对质量标准制定中一些需重点关注之处进行说明。1 PEG的平均修饰率目前，PEG修饰蛋白的质量标准中平均修饰率的检测方法主要有：三硝基苯磺酸（TNBS）法、荧光胺法、质谱法、液相-示差/蒸发光检测器联用法等。其中，前两种为间接测定法，要求对修饰前后的蛋白质准确定量。该类方法属普通的化学与荧光发光法，操作相对简单；后两种属于直接测定法，虽然结果较为准确，但所用仪器较为特殊或昂贵。因此，建立质量标准时，应考虑采用直接法获得较为可靠的平均修饰率数值，随后

5、建立三硝基苯磺酸（TNBS）法或荧光胺法而纳入标准。同时，如能成功建立直接法中的“液相-示差/蒸发光检测器联用法”，不仅可以准确控制单位点或多位点修饰的PEG-rhGH的平均修饰率，还可以同时进行游离PEG测定，以及PEG的定性鉴别。1.1 质谱法由于PEG的分子量较大，多采用基质辅助激光解吸附飞行时间质谱（MALDI-TOF）测定修饰前后生长激素的质量数，将质量数之差除以PEG的分子量，即可得到每一分子rhGH上，发生修饰的PEG数目。但是，由于MALDI-TOF脉冲式的离子化方式不能精确定量，对于发生多点修饰的rhGH，只能用该方法计算PEG的结合数目，而无法准确计算平均修饰率。因此，该方

6、法只适用于计算单位点修饰药物的平均修饰率。目前我国企业生产的3种PEG-rhGH，均为单位点修饰，利用MALDI-TOF测定的平均修饰率应为10%左右。1.2 TNBS法1966年，Habeeb等人采用三硝基苯磺酸（TNBS）与蛋白表面赖氨酸的-氨基和氨基发生反应，生成在375nm处有特征吸收的三硝基苯酚（TNP）。对于采用游离氨基作为蛋白连接位点的PEG修饰蛋白，PEG修饰将直接减少蛋白表面的自由氨基，因此可以通过将吸光度值与蛋白浓度作图，求得PEG-rhGH与rhGH的斜率，将两者的斜率之差除以rhGH的斜率即可间接计算PEG的修饰程度。但是，该方法的影响因素较多，要求修饰前后的供试品中不

7、得含有游离氨基，不得含有还原型物质，不得含有SDS等表面活性剂，并且极易受到环境温度、pH以及游离PEG的影响。同时，该方法中络合物随着反应时间的延长，吸光度值不断下降，需要考察适宜的反应中止方法以保证测定准确性。而rhGH国家对照品中因为添加了甘氨酸等赋形剂，不能直接用于TNBS法的检测。企业需考察 rhGH与PEG-rhGH在不含上述辅料剂型中的稳定性，并提供rhGH的工作对照品。1.3 荧光胺法Stocka等人首先采用荧光胺法测定PEG修饰蛋白的平均修饰率6。该方法的灵敏度较高，仅需纳克级的蛋白质就能完成。荧光胺本身不发荧光，但可在碱性环境中共价结合到游离氨基上，生成具有高荧光强度的荧光

8、衍生物。没有参与反应的荧光胺则迅速水解为不发荧光的物质。因此，与TNBS法相比，荧光胺法具有更高的灵敏度。与TNBS法相似，荧光胺法同样受反应温度、pH值、时间因素、游离氨基、还原物质的影响，所以应针对不同的PEG化蛋白进行反应条件考察，并建立相应的rhGH工作对照品。同时，由于荧光胺在水溶液中分解极快，为保证操作的便捷与准确性，应将荧光胺的丙酮溶液直接加入到反应液中，并迅速混匀，而不宜在接触到蛋白质溶液之前用水溶液稀释荧光胺。上述两种方法进行准确测定的前提条件是，无论修饰前后，rhGH都必须处于充分舒展的状态，所有的结合位点都能充分暴露。但是，由于PEG枝杈型的空间位阻效应，同时方法易受常规

9、变性剂的干扰，测定结果不可盲目追求理论平均修饰率10%，应根据多批次测定结果，合理制定限度范围。1.4液相-示差/蒸发光检测器联用法PEG分子在280nm下并无特征紫外吸收，而活化后的PEG分子，由于活性基团的引入，可能存在214nm下的紫外吸收。因此，为了检出以各种形式存在的PEG，应采用通用型检测器，并结合凝胶或反相等高效液相色谱对修饰前后的rhGH及游离的PEG进行分离。由于示差检测器的灵敏度较低，同时只能使用恒梯度流动相，因此，不适于检出痕量的游离PEG。而蒸发光检测器在上述方面有较大优势。首先通过优化色谱条件，将PEG-rhGH、rhGH与游离PEG有效分离后，再将PEG从修饰后的r

10、hGH上水解下来；通过计算水解后PEG减去游离PEG的量，再除以PEG的分子量得到偶联到rhGH上的PEG的摩尔数，进而通过紫外检测器求得rhGH的摩尔数，两者之比再除以10（每分子rhGH的理论修饰位点），即可求得较为准确的平均修饰率。该方法不仅可适用于单位点或多位点PEG-rhGH的平均修饰率测定，而且可有效鉴别不同生产厂家使用的不同种类的PEG，同时可测定原液中的游离PEG含量，实现一个方法进行三项重要指标的质量控制。但是，目前该类方法可供参考的国内外文献极少，方法的建立需要投入较大的工作量。2 PEG的修饰位点rhGH上可发生PEG修饰的位点有10个，即使均为单位点修饰，理论上也可能存

11、在10种位点异构体。同时，PEG分子本身是由一系列具有一定分子量分布的物质组成的混合物，因此，每一种位点异构体也就成为了较复杂的混合物。这就给PEG修饰位点的测定带来了巨大的难度。目前可采用2种方法进行PEG修饰位点的测定：液相肽图法与离子交换分离位点异构体法。这两种方法都需要结合质谱，对rhGH液相肽图中的色谱峰准确定性。在此基础上，前者推断修饰位点，后者可较为准确地测得修饰位点。2.1 液相肽图法首先需建立适宜的rhGH与PEG-rhGH的酶切方法。由于PEG是具有枝杈结构的大分子物质，与蛋白质分子共价结合后，由于其空间位阻的屏蔽作用，使得蛋白酶很难作用于PEG-rhGH，这也是PEG-r

12、hGH在体内具有较长半衰期的原因。因此，对于PEG-rhGH，不能照搬rhGH药典酶切方法，应深入研究个酶切参数，使得蛋白酶既能完全水解rhGH与PEG-rhGH，得到尽可能多的理论肽段，又能避免非特异性酶切片段的产生。随后应建立适宜的反相液相肽图分离方法。一个经过优化的RP-HPLC液相肽图，是控制PEG-rhGH修饰位点最直观和便利的方法。因此，不可照搬rhGH药典液相肽图法，需反复优化色谱分离条件，使得通过比较修饰前后的肽图，既可推断PEG的修饰位点，又可将不同种类的PEG-rhGH与rhGH区分开。二硫键未被还原的rhGH经胰蛋白酶酶切后，应产生19个理论肽段，除去3个极性很强无法保留

13、的肽段T3、T5、T18以及1个仅含有1个lys的T17，应在RP-HPLC肽图上出现至少15个肽段。同时通过还原酶切液，可推断两个二硫键肽段T20-SS-T21与T6-SS-T16的色谱峰位置。由于T20-SS-T21本身不含有PEG的修饰位点，T19肽段也不含有PEG修饰位点，因此在PEG修饰前后rhGH的酶切液中，该肽段不会发生峰位置和峰面积的变化。那么在酶切完全的前提下，rhGH酶切液中各个肽段的峰面积与T20-SS-T21或T20的峰面积之比（k值），应为一个相对固定的数值。而在PEG-rhGH的酶切液中，连有PEG的肽段，其保留时间将发生改变。虽然由于位点异构体的存在，该位点仍有未

14、被PEG化的肽段出现，但是这一位置肽段的k值与未修饰rhGH的k值比较，应有所下降，且降低的程度反应了被修饰肽段的相对含量。因此，通过大量实验，可累积获得rhGH与PEG-rhGH各肽段的平均k值，根据两者的k值变化，可以推断哪些位点发生了主要的修饰及修饰肽段的大致含量。由于有些PEG的位点异构体所占比例可能较低，难以通过k值变化进行测定，应尽可能对主要修饰肽段进行控制。方法成功建立后，除了可用于原液的鉴别检查外，还可在质量标准中规定发生主要修饰的肽段，其峰面积百分比不得超过的限值。由该方法确立的主要修饰位点及所占比例，可通过两种以上蛋白酶酶切及阳离子交换色谱与等电聚焦电泳进行深入的验证分析。

15、2.2 离子交换分离位点异构体法目前我国企业研发中的几种PEG-rhGH，PEG的修饰均发生在赖氨酸侧链的氨基和N端a氨基上，尚无定位在巯基的修饰。PEG修饰的位点异构体同时也成为了电荷异构体，因此可以采用离子交换色谱进行分离。发生修饰后的rhGH，其等电点将向酸性端偏移，试验中也发现，阳离子交换树脂的分离效果要好于阴离子交换树脂。但是，由于PEG-rhGH有较多的位点异构体，在离子交换色谱柱上实现所有位点异构体的完全分离，难度极大。建立该方法时，首先应保证主要修饰成分与次要修饰成分的有效分离，再通过优化方法，尽量分开次要修饰成分。在保证方法可靠的基础上，也可适当降低对次要修饰成分之间分离度的

16、要求。经过离子交换分离到的各位点异构体，应进一步浓缩，重新定量后进行酶切肽图分析。将该肽图谱与未修饰的rhGH的肽图比较，PEG肽图谱中缺失肽段中的赖氨酸即为PEG的修饰位点。也可进一步分离、收集位点异构体肽图中的PEG修饰肽段，通过N端测序，找到修饰位点。该方法不仅可对PEG的位点异构体进行控制，还可对PEG-rhGH的电荷异构体进行控制。如产品在效期内存放时因脱氨等作用而产生的有关物质，也有可能引起峰形及相对峰面积的变化。因此，在稳定性考察时，很有必要引入此方法。3 结语PEG-rhGH虽然是建立在rhGH上的以延长体内作用时间为目的的研发产品，但是由于PEG的引入，使得改构后蛋白质在理化

17、性质、体内体外活性上的复杂程度，都远远超出rhGH。对PEG-rhGH的质量控制，应以结构确证为重点，特别需要准确说明PEG的主要修饰位点是哪几个氨基酸。必要时还应进行PEG对rhGH在高级空间结构上的影响研究，并分离主要的、次要的位点异构体进行深入的体内外活性研究。由于rhGH的构效关系已非常明确，且其体内活性实验难度较大，在各国药典中均已采用理化含量测定代替生物学活性的效价测定方法。但是，PEG-rhGH的位点异构体繁多，结构确证难度较大，各异构体的活性、毒性研究可供参考的资料也极少。因此对于PEG-rhGH的效价测定，不能盲目地以理化蛋白测定方法直接替代。该制剂质控研究的另一个努力方向，

18、应该是建立准确、便捷、经济的体外活性测定方法，与理化测定法联合应用，共同对PEG-rhGH的效价进行控制。目前rhGH的国外生产厂家有6家，全球年销售额超过27亿美元，说明其巨大的市场与需求量7。改构后的PEG-rhGH更可以极大地提高患者的依从性，改善其生活质量。因此，各生产厂家应持续深入地对PEG-rhGH进行药学研究，努力提高产品质量，使其成为安全、有效、质量可控的产品，从而能够早日服务于患者。参考文献1. Naoki H, Takanori S, Takami Y, et al. GH, GH Receptor, GH Secretagogue Receptor, and Ghreli

19、n Expression in Human T Cells, B Cells, and Neutrophils. J Clin Endocrinol Metab, 2001, 86: 4284-4291。2. Qin HN, Xiu ZL, Zhang DJ, et al. PEGylation of Hirudin and Analysis of its antithrombin activity in vivo. Chem. Eng., 2007, 15:586-5903. Roberts MJ, Bentley MD, Harris MJ. Chemistry for peptide and protein PEGylation. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, 54: 459-476.4. Webster R, Xie R, Didier E, et al. PEGylation