红洋葱(Allium cepa L.)提取物补充改善鼠的氧化应激反应中的氧化还原的平衡

1、石河子大学科技外语结课论文红洋葱（Allium cepa L.）提取物补充改善鼠的氧化应激反应中的氧化还原的平衡 学生姓名 学号2013106006专业农产品加工及贮藏所在学院食品学院 红洋葱（Allium cepa L.）提取物补充改善鼠的氧化应激反应中的氧化还原的平衡Nidhi Jaiswala, Dileep Kumarb, Syed Ibrahim Rizviba.阿拉哈巴德大学食品科技中心，印度阿拉哈巴德211002b.阿拉哈巴德大学生物化学系，印度阿拉哈巴德211002摘要：洋葱，植物性膳食的一个很好来源，被证明具有抗氧化特性，在全世界范围内被销售。儿茶素和槲皮素是最常见的并且被广

2、泛食用的类黄酮。本实验旨在调查洋葱提取物和类黄酮（儿茶素和槲皮素）对受到氯化汞（HgCl2）作用的鼠产生氧化应激反应可能的保护作用。实验在鼠的红细胞中进行，它是研究氧化应激反应的一个很好的系统模型。实验结果表明HgCl2诱导威斯塔鼠氧化应激，导致红细胞脂质过氧化增加和活性较高的红细胞质膜氧化还原系统（PMRS），同时相应的降低细胞内还原型谷胱甘肽和抗氧化活性。洋葱提取物对HgCl2引起的不利影响有显著（p<0.05）的补充和减毒作用。黄酮类补充作用比洋葱提取物有略高的抗氧化反应。我们得出结论，黄酮类补充导致红细胞内细胞质膜氧化还原系统（PMRS）的活性正常化，用洋葱提取物（富含槲皮素）一

3、个新颖的机制来发挥它的抗氧化作用来抵抗HgCl2诱导的在鼠红细胞内的氧化应激。关键字：洋葱，儿茶素和槲皮素，氯化汞，氧化应激，抗氧化活性，细胞质膜氧化还原系统（PMRS）1. 前言 黄酮类化合物是一大群天然存在的酚类成分，广泛存在于食用植物，蔬菜和水果中。流行病学证据表明，消耗富含黄酮类化合物的食物和饮料与降低各种疾病的风险相关，包括某些癌症，心血管疾病和氧化压力相关的疾病1。超过6000种黄铜类化合物已确定，其中槲皮素（大量存在于洋葱、苹果、西兰花和浆果中）和儿茶素（大量存在于茶中）是最常见和广泛食用的黄酮类化合物2。洋葱 (Allium cepa L.),一个广泛食用的蔬菜，很好的膳食植物

4、化学（有机硫磺化合物和黄酮类，尤其是槲皮素）来源,已证明其具有抗氧化性能和调节排毒系统的能力3,4。不同的科技报道已证实了它的功能属性，包括自由基清除剂活性、免疫刺激、心血管效应（通过降低血清胆固醇和血压），抗癌和抗感染性属性5。 各种退化性和代谢疾病，如糖尿病、动脉粥样硬化、癌症和衰老都是已知的导致氧化应激6。近年来，新的兴趣朝向研究植物和它们的分离化合物，为预防疾病和不同的病理条件来防止细胞损伤和氧化应激7。 目前的研究报道的洋葱提取物、槲皮素、儿茶素的抗氧化作用对老鼠模型的氧化应激实验中血液中氧化应激标记（等离子体膜氧化还原系统、等离子体的抗氧化能力、红细胞脂质过氧化和细胞内还原型谷胱甘

5、肽）的影响。2. 材料和方法2.1 化学药品槲皮素，（+）儿茶素，2,4,6-三（2-吡啶基）-S-三嗪（TPTZ），4,7-二苯基，1,10-菲洛啉二磺酸二钠盐（DPI），还原型谷胱甘肽和二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）购买于美国的圣路易斯的 Sigma Aldrich公司。所有其他分析级化学品采购于印度的 Merck公司和印度的Himedia实验室。2.2 提取物的制备 在印度的阿拉哈巴德当地市场购买新鲜的洋葱鳞茎，在印度，不同地方的洋葱品种不同，红洋葱（(Pusa品种）是最好选择的，因为它有较高的抗氧化潜力3。收集的植物，它的植物识别和认证被证实，植物标本单送往阿拉哈巴德大学干燥部的植物学

6、。获得凭证标本编号（参考号25840）。鳞茎经小心包装和冷藏（4）。在磨床中用100毫升的冷冻，将大约100克的洋葱用研磨机粉碎，加入100毫升冷水，蒸馏水，由此产生的泥浆用滤布挤压和过滤，将所得滤液快速冷藏到4直到被使用。2.3 动物模型和研究协议 实验用48个雌性威塔鼠（5±0.5个月，体重150±20g）。把它们放在一个温度可控制的房间（25±5）12小时的明暗循环至少一周。一周的稳定时间过后，老鼠被随机分成8组，每组六只。洋葱提取物和黄酮类（儿茶素和槲皮素）交由填味法30天。类黄酮在一定反应条件下可显示促氧化活性。因此，我们选择最佳用量为类黄酮治疗，正如先

7、前研究所报道的8。第一组：控制，不接受处理/补充。第二组：洋葱提取物处理组（1毫升/100克体重/天）30天。第三组：仅用槲皮素，槲皮素用0.5%DMSO溶解，每天通过喂食法（20毫升/公斤体重）对老鼠治疗，为期30天。第四组：仅用儿茶素，儿茶素用0.5%DMSO溶解，每天通过喂食法（20毫克/公斤体重）对老鼠治疗，为期30天。第五组：不受控制，在0.9%的氯化钠条件下，用氯化汞5毫克/公斤体重对老鼠腹腔注射9。第六组：洋葱提取物加上氯化汞处理，先将洋葱提取物（1毫升/克体重）通过喂养10天，再注入氯化汞和洋葱提取物再持续30天。第七组：槲皮素加上氯化汞处理组，槲皮素用0.5%DMSO溶解，并

8、先给与10天(20毫克/公斤体重/天)的喂养，之后再注入氯化汞和槲皮素到下一个30天。第八组：儿茶素和氯化汞处理，儿茶素用0.5%DMSO溶解，先给予10天（20毫克/公斤体重）喂养，再注射氯化汞和儿茶素持续到下一个30天。2.4 收集血液，红血细胞和血浆的分离 老鼠经轻微麻醉处死，通过心脏穿刺10单位/毫升肝素来采集血样，在4，经10分钟，800的相对离心力将红细胞粉碎。除去血浆之后（立即冻结在-80，直到用于生化指标）得到白血球和上层15%的红血球浓厚液，红血球浓厚液经冷磷酸盐缓冲盐水（0.9%氯化钠和10毫摩尔/升磷酸氢二钠，PH为7.4）冲洗两次，然后用于实验。所以实验的协议都经阿拉哈

9、巴德大学的动物保健和伦理委员会批准。2.5 FRAP法测定总抗氧化活性 使用 Benzie and Strain的铁离子还原法测定血浆样品的总抗氧化能力，试剂准备，300mmol/L的乙酸盐缓冲液，PH值为3.6,20mmol/L氯化铁和10mmol/L的TPTZ由40mmol/L的盐酸稀释。三种物质分别按体积比10:1:1混合，3ml的铁离子试剂与100uL的血浆完全混合10。在593nm，30秒的间隔4分钟的条件下测吸光度。已知水溶液中铁离子的浓度范围在100-1000umol/L，用于校对。血浆中铁离子还原值的回归方程用于计算。2.6 红细胞丙二醛（MDA）含量的测定 用Esterbau

10、er和Cheeseman轻微改良的方法测红细胞丙二醛11。红血球浓厚液（0.2ml）悬浮在3ml,含有0.5mmol/L葡萄糖，PH为7.4缓冲液中。向0.2ml的溶菌产物中加入1ml，10%的三氯乙酸（TCA）和2ml,0.67%硫代巴比妥酸（TBA）在90-100的温度下煮20分钟，冷却后以1000的相对离心力,对混合物进行离心，离心时间5分钟，在532nm下，测上层液吸光度。用消光系数（=31500）计算红细胞中丙二醛的浓度，以纳摩尔每毫升表示红血球浓厚液。2.7 红细胞谷胱甘肽的测定 用Beutler的方法来测谷胱甘肽（GSH）,此方法基于巯基减少DTNB的能力，并形成一个黄色的阴离子

11、产品，在412nm下测吸光度12。以毫克每毫升表示红血球浓厚液的浓度。2.8 红细胞PMRS的测量 用Avron and Shavit的方法测红细胞中的PMRS13。简单地说，将0.2毫升的红细胞悬浮于含有5mmol/L葡萄糖和1mmol/L现配制的铁氰化钾的缓冲溶液，最终达到体积为2.0毫升。将悬浮液在37下培育30分钟，然后在4下,以相对离心力1800，进行离心。收集的上清液使用分辨率检测亚铁氰化物的含量，并在535nm下测吸光度。在微摩尔亚铁氰离子的红血球浓厚液中表达30分钟。2.9 统计分析使用GraphPad Prism 4.00版本Windows,GraphPad软件（都经圣地亚哥

12、认证中心认证）进行统计分析，在最后的第四周，将含氯化汞的洋葱，含氯化汞的儿茶素，含氯化汞的茶多酚各组中的红细胞减少数与氯化汞组（p<0.05）和（p<0.001）对比图3B。对洋葱提取物和儿茶素进行处理，引起谷胱甘肽水平（13.92%和20.70%）轻微增加，而相比控制组,对槲皮素处理导致更高的谷胱甘肽水平（37.02%）（p<0.001)图4A,相比控制组,经氯化汞处理的红细胞谷胱甘肽显著减少，（p<0.001）图4B，用氯化汞对洋葱提取物，儿茶素和槲皮素一起处理，和氯化汞组相比，显著提高了谷胱甘肽水平。（P<0.001）,(Fig. 4B)。观察到，受氯化汞威

13、胁的老鼠与控制组相比，红细胞中PMRS的活性明显增加。（p<0.001）图5。观察到受氯化汞威胁的老鼠，当用洋葱提取物，儿茶素和槲皮素混合处理时，红细胞中PMRS活性相比氯化汞组明显降低。3. 结果氯化汞处理四周后观察老鼠，体重明显下降（p<0.05）（图一）。FRAP法测定所有小组中血浆的抗氧化能力。用洋葱提取物，儿茶素，槲皮素处理（p<0.05）与控制组(p<0.01)相比血浆中抗氧化潜力增加（图2A）。HgCl2 处理加上洋葱提取物，槲皮素或儿茶素处理老鼠与HgCl2 处理组相比，）血浆中抗氧化潜力具有显著优势（图2B）。在第四周结束时，HgCl2组中MDA水平与

14、控制组相比明显增加（P<0.001）(图3B)。相反，观察到用洋葱，儿茶素或槲皮素处理的鼠数据没有显著的变化。（图3A）。在红细胞第四周期结束时，与HgCl2 组（P<0.05）和（P<0.001）（图3B）相比，洋葱+HgCl2，儿茶素+HgCl2组和槲皮素+HgCl2组MDA水平明显减少。当与控制组相比时（P<0.001）(图4A),洋葱提取物和儿茶素处理可引起GSH水平微量的增加（13.92%和20.70%）（P<0.001)，而，槲皮素处理显示GSH水平更高（37.02%）。与控制组（P<0.0001）(图4B)相比，HgCl2 处理组红细胞GSH显

15、著减少。用洋葱提取物，儿茶素和槲皮素及HgCl2等一起处理比仅用HgCl2 处理组，GSH水平明显得到提高(P<0.001)（图4B）。相比控制组（P<0.0001）(图5)，用HgCl2 处理鼠红细胞中PMRS活性明显增加，相反，仅用洋葱，儿茶素和槲皮素处理，红细胞中PMRS没有显著活性。（图5A）。相比HgCl2 组（图5B）,用HgCl2 加上洋葱提取物（P<0.001），儿茶素和槲皮素(P<0.0001)处理鼠，观察到PMRS活性明显降低。图一，30天期间氯化汞处理对鼠的体重影响 图二，洋葱提取物，儿茶素和槲皮素对氯化汞处理诱导的血浆中总抗氧化能力氧化应激（就F

16、RAP值来衡量）在威斯塔鼠品系内，FRAP值以血浆中mol/L二价铁离子表示，值代表平均值+/-标准偏差。 图三，洋葱提取物，儿茶素和槲皮素对体内氯化汞诱导鼠氧化应激对红细胞中丙二醛（MDA）含量的影响。丙二醛浓度以nmol/ml红细胞浓厚度表示，值表示平均值+/-标准差。图四，洋葱提取物，儿茶素和槲皮素对氯化汞诱导氧化应激对红细胞谷胱甘肽含量的影响，谷胱甘肽浓度以mg/ml红细胞浓厚度表示，数值表示平均值+/-标准偏差。图五，洋葱提取物，儿茶素和槲皮素对氯化汞诱导鼠氧化应激对红细胞质膜氧化还原系统（PMRS）的影响，PMRS的活性以没30分钟红细胞浓厚度的微摩尔每毫升亚铁离子浓度表示，值代表

17、平均值+/-标准偏差。4. 讨论氧化应激是一个有害条件，当细胞组织损害时发生，包括蛋白质，脂质和DNA6。氯化汞（HgCl2 ）是汞形式中最有毒之一，一旦被吸收到血液中会与血浆中蛋白质结合或进入红细胞14。以前的研究已表明，氯化汞中毒性老鼠会产生活性氧，进而发生氧化应激9。在目前的研究中，我们的观察，受HgCl2 处理30天后鼠的体重明显减少，符合先前发表的报告15。所知道的重量的减少基本方面是汞毒性和归于食物摄入量的减少。血浆的抗氧化能力是主要的测量和可靠的标记来评估氧化应激引发的病理事件。目前的研究表明，氯化汞处理组抗氧化能力下降以FRAP值计算，而类黄酮的补充导致HgCl2 处理鼠抗氧化

18、潜力提高。结果与先前报告一致，先前的报告已表明，黄酮类化合物（槲皮素）通过口服，增强鼠血浆中的抗氧化能力，表明共轭代谢参与了抗氧化基防御16。脂质过氧化反应（LPO）是多不饱和脂肪酸氧化降解的过程,在生物膜内发生，引起生物膜功能受损，结构完整性，膜流动性下降和几种膜结合酶失活17。在氧化应激下，红细胞膜易发生脂质过氧化反应，多不饱和脂肪酸的双键断裂，以致MDA的形成，MDA的增加是脂质氧化反应的一个重要指标。红细胞中MDA水平的增加伴随着氧化应激反应，在许多疾病已有过报道17。在这项研究中，HgCl2处理由自由基产生的脂质过氧化反应的增加。这种毒性可能是由于汞通过连续的氢过氧化物形成活性氧，诱

19、导细胞膜完整性的改变和体内多不饱和脂肪酸裂解或由于抗氧化防御机制的微扰。还原型谷胱甘肽（GSH）是细胞内主要的抗氧化剂存在于几乎所有的活细胞内包括红细胞，被认为是在细胞内氧化还原水平的生物指标。谷胱甘肽的抗氧化系统在细胞内起着根本性的作用，防御自由基反应和其它类氧化剂。GSH已经显示出脂质过氧化反应的加强和细胞易患氧化损坏17。HgCl2处理组鼠红细胞谷胱甘肽显著减少，表明由于汞中毒，氧化应激反应在鼠中盛行。单个汞离子可以结合并引起高达两个GSH分子的不可逆排泄。原因是汞有很强的巯基（SH）亲和力结合基团，特别是内源性生物分子18。释放的汞离子与GSH形成络合物，从而干扰它的代谢14。由于汞和

20、谷胱甘肽结合从和随后细胞内的谷胱甘肽的消除，细胞中谷胱甘肽的含量降低，主要表现为细胞抗氧化潜力的减少。汞中毒后引起的氧化失衡的结果，由许多研究显示证实，在肾脏和其它组织MDA的值升高和GSH成分的减少9,15。一个重要的血液报告显示，来反映氧化应激对MDA和GSH的影响19。我们观察到洋葱提取物起到保护作用，明显地，通过脂质氧化显著的减少和红细胞中GSH成分及血浆的抗氧化活性的增加。来抵抗HgCl2引起的的氧化应激。这与先前的研究结果一致，先前的研究表明，洋葱的补充丰富饮食，使鼠血浆中抗氧化能力增加20。现在的观察解释可能是由于红洋葱中黄酮类化合物的存在（特别是槲皮素）。这是可能的，该提取物的

21、抗氧化成分可能会作为牺牲的抗氧化剂补充内源性GSH在HgCl2诱导的氧化应激过程中的耗尽。此外，饮食的多酚已显示出c-谷氨酰半胱氨酸合成酶，GSH的生物合成限速酶上调的现象21。这或许可以部分解释，用洋葱提取物可以增加氯化汞处理鼠中GSH含量。洋葱提取物的高抗氧化性能也可归因于有机硫含有半胱氨酸衍生物（S-甲基亚砜），在谷胱甘肽生物合成中限制底物速率，同时还发现可通过清除自由基预防和改善氧化应激性反应4。现在的研究表明，口服槲皮素和儿茶素可有效抑制活的有机体内的脂质过氧化作用，控制抗氧化能力的增加及HgCl2诱导的氧化应激鼠。这种保护可能是归于红细胞膜的稳定性，由于抗氧化剂的结合从而阻止膜的物理伤害，及更有效的自由基清除剂22。它还涉及转录因子（如，Nrf2）调节基因编码表达和间接激活抗氧化酶23。据报道，儿茶素可清除超氧自由基，羟自由基和抑制脂质过氧化8。它螯合铁，使具有清除超氧化物和降低脂质过氧化的属性，通过其结构特点（儿茶酚团在B环和一个羟基基团在C环）。此外，膳食类黄酮与第一阶段和第二阶段酶系统相互作用，从而一个重要的酶谷酰胺合成酶的调节表达，促使谷胱甘肽的合成21。最近，儿茶素和槲皮素的保护作用在农