市场常见DNA测序仪PPT课件

1、测序技术概况测序仪器的原理和特性常见测序仪器的比较如何选择合适的测序仪第1页/共16页Sanger双脱氧链终止法MaxamGilbert DNA化学降解法循环芯片技术实现了高通量、高效率、高准确度的测序大大降低了测序的成本单分子测序试剂用量少，成本更低第一代测序技术第二代测序技术第三代测序技术第2页/共16页代表仪器测序原理ABI 3730XLsanger 法：毛细管电泳分离电脑荧光检测数据分析可得到DNA碱基序列第一代第3页/共16页第一代ABI3730XLu 毛细管规格: 96道毛细管u 毛细管长度: 50cmu 凝胶的规格: POP-7液体分离胶u 配套的试剂: 基因测序(BigDye3

2、.1v和5Sequence buffer) 基因分型(Liz120, Liz500, ROX500)u 基因测序及分型的运行时间 时间：96样本 2h 通量：（94-96）/384*12u 读长：700-900bp优势：u 方法可靠、准确度高,且已形成规模化, 特别是在 PCR 产物测序、质粒和细菌人工染色体的末端测序、以及STR基因分型方面,发挥着重要作用. 性能：不足：u 通量低；成本相对较高第4页/共16页测序原理：l文库制备 l乳液PCR扩增 l焦磷酸测序 第二代ROCH-454Illumina GA ABI SOLID测序原理：l制备DNA文库l乳液PCR/微珠富集l连接酶测序lSO

3、LID的双碱基编码矩阵测序原理：l制备DNA文库l桥式PCR产生DNA簇l测序第5页/共16页第二代ABISOLID优势：u系统可扩展性u最大的灵活性u全基因表达图谱分析u更多RNA研究uSNP分析u甲基化分析第6页/共16页第二代Illumina GA技术特点：u测序通量高：每个测序反应能达到3G以上的数据通量；u 准确率高： 98.5%，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题；u 低成本：比传统毛细管测序技术成本的1%还低；u DNA序列的读取长度不断增加，当前达到200 bp；u 可以进行Pair-End双向测序，目前Pair-End文库插入片段大小范围可由200bp到10kb；u 每

4、张芯片有8个通道，每个通道可单独测序一个样品，也可以把多个样品混合在一起测序。优势：u可扩展的超高通量u需要样品量少（低至100ng)u简单、快速、自动化u单个或配对末端支持第7页/共16页第二代ROCH-454技术特点：u在7.5小时的一个设备运行时间内，可以读取超过1亿个的碱基信息u更长的读长，平均可达200-300个碱基u更高的通量，每次运行可获取超过40万个读长u超过200个碱基的单个读长准确性大于99.5u一致准确性大于99.99u无需克隆和挑取克隆子的操作过程u生成完整的基因组库，避免了克隆偏差的影响优势：u454平台的最突出优势是读长，目前454系统的序列读长已超过400 bp，

5、但成本也相对较高第8页/共16页最后借助聚合酶将荧光标记的单核苷酸掺入到引物上。采集荧光信号，切除荧光标记基团，进行下一轮测序反应，如此反复，最终获得完整的序列信息代表仪器测序原理HeliScope单分子边合成边测序将基因组DNA切割成随机的小片段DNA分子，并且在每个片段末端加上poly-A尾通过poly-A尾和固定在芯片上的poly-T杂交，将待测模板固定到芯片上，制成测序芯片第三代第9页/共16页第三代HeliScope技术特点：u它的测序是不同步的，即每条模板测序的程度不同，依据模板本身的序列而定，但由于使用的是单分子测序，故不会存在相移问题。u在荧光标记的核苷酸上没有终止基因。u可以

6、通过“两步法”，即测序两次来提高测序的准确性。u由于大量的来标记碱基、不发光碱基或污染碱基掺入，所以使用HeliScope测序仪检测缺失突变的出错率最高，单次检测误差率为2%-7%，两次检测误差率为0.2%-1%。不过检测碱基替换突变的准确率是目前测序仪中最高的。优势：u单分子测序减少了试剂的使用，测序成本价格大大降低u不需要扩增建立DNA库，从而切断数据结果中潜在错误的来源 第10页/共16页常见测序仪的比较由上表可以看出，第二代和第三代测序仪由于消耗的试剂少在测序费用上有了明显的降低，但是在读长上第一代的3730 xl依然具有绝对的优势，不过随着技术的完善，新一代的测序仪依然拥有极大的提升

7、空间。第11页/共16页本片五种测序仪的比较第12页/共16页测序的准确度和各自的优势的考虑：项目考量：如何选择合适的测序仪比如是善于发现插入、缺失突变还是善于发现碱基替换突变。比如重测序对于测序长度的要求没有从头测序的要求高；对于需要依靠标签计数的测序项目，会更加需要能将待测片段分割成尽量多、尽量小片段的测序方法。费用考量：3730 xl适用于对kbmb长度的DNA片段 进行的小规模的测序项目。大规模测序项目中大家还是倾向于选择新一代测序仪，主要差距在于费用，新型测序仪能将测序费用降低几个数量级。第13页/共16页附录三代测序技术的总结第一代测序技术凭借其长的序列片段和高的准确率，适合对新物种进行基因组长距框架的搭建以及后期GAP填补，但是成本昂贵，而且难以胜任微量DNA样品的测序工作。第二代测序技术中：u454序列片段最长，比较适合对未知基因组从头测序，搭建主体结构，但是在判断连续单碱基重复区时准确度不高。uSolexa较454具有通量高、片段短、价位低的特点，可以用于大基因组和小基因组的测序和重测序。uSOLiD基于双碱基编码系统的纠错能力