深圳市龙华区一起输入性登革热疫情的分子流行病学研究

1、深圳市龙华区一起输入性登革热疫情的 分子流行病学研究许少坚 任燕 赖晓玲 赵琼 全德甫 蔡妙森 陈宏标 周小峰方捷 甘中胤罗经伟周世权刘丽珍彭伟m王金明林启辉深圳市龙华区疾病预防控制中心龙华新区传染病预 防控制重点实验室摘耍： 目的对2017年深圳市龙华区一起输入性登革热病原体进行分子遗传学分析。方 法利用c6/36细胞从病人血清中分离登革热病毒(dengue virus, denv),对 分离得到的denv的e基因进行测定和系统发牛树构建，结合现场流行病学资料 对其分子遗传学进行分析。结果成功分离得到1株denv-1,命名为 szuh7jb00855£17°e基因的扩增获

2、得两条目的产物，分别为1 010 bp和829 bp。 目的产物经测序拼接后，最终得到长为1 485 bp dna序列;ncbi数据库多序列 在线比对结果显示szlhjjb008552017毒株e基因与越南2007、2008及2011年 分离毒株e基因序列的覆盖率在99%100%之间；系统发牛树分析结果显示， szlhjjb008552017 与 vnbid-vi686/2007、vnbid-v1691/2007、 vxbid-v3908/2008> vnbid-v3909/2008、vn09dx879/2011 亲缘性最近，与近年 来广东省各地市暴发的分离株亲缘性较远。结论现场流行病资

3、料和实验室分子 遗传学分析都提示本案例报告的登革热病例属于输入性病例，输入地极有可能 是越南。关键词：登革热病毒;系统发生树构建;进化分析;作者简介：许少坚(1984),男，硕士，技师，研究方向:病毒性传染病病原 谱监测及进化分析。作者简介：林启辉，e-mail :294769403qq. com收稿日期：2017-08-29 基金：深圳市科技创新基金项冃(no. 20150402162704224)molecular epidemiologic study on an imported dengue fever case in longhua distriet, shenzhenxu sha

4、ojian ren yan lai xiaoling zhao qiong quan defu cai miaosen chen hongbiao zhong xiaofeng fangjie gan zhong yin luo jingwei zhou shiquan liu lizhen peng weijun wang jinming lin qihuilonghua distriet center for disease control andprevention, distriet key laborstory forinfectious disease prevention and

5、 control, shenzhen;abstract：objective to conduct a molecular genetic analysis of the pathogen of an imported dengue fever case in longhua district of shenzhen city. methods by using c6/36 cells, dengue virus (denv) was separated from the patient serum, the sequence of the e genes of denv obtained wa

6、s determined and the phylogenetic tree was constructed, and then a molecular genetic analysis was done in combination with the onsite epidemiological infonnation. resuits one strain of denv-1 was successfully separated and named as szlh17jb00 8 5520 1 7e after amplification, two targct products were

7、 obtained, which were 1 010 bp and 829 bp, respectively. after sequencing, the dna sequence was 1 485 bp. ncbi database multi-sequence online comparison showed:the coverage of the e gene of the szlhi7jb00855201 7 strain and that in vietnam isolated in 2007, 2008 and 2011 between 99%and 100%. the phy

8、logenetic tree analysis showed that szlh17jb008552017 was the relatively closest to vnbid-v1686/2007, vxb1d-v1691/2007, vxbid-v3908/200& vnbid-v3909/2008 and vn09dx879/2011, and less close to the separated strain that had been broken out in the cities and districts of guangdong province in recen

9、t years. conclusion both onsite epidemiological information and laboratory molecular genctic analysis indicate that the current reported dengue fever case is an imported case, and the exporling place may be vietnam.keyword：dengue virus; phylogenetic tree; genetic analysis;received： 2017-08-29登革热（den

10、gue fever, df）是登革热病毒（dengue virus, denv）经蚊媒传播 引起的急性虫媒传染病，广泛流行于热带和亚热带地区，已成为全球严重的公 共卫牛问题据who统计，1970年前，仅有9个国家出现过较大规模的登革 热暴发流行及1，而当今全球约有128个国家或地区的39亿人口受到登革热感染 的风险r1，其屮约9 600万人出现临床症状£41。我国df主要流行于广东、广 西、福建、海南和台湾等省份。近年来，广东省的流行趋势加重，2013和2014 年连续2年发生了登革热的暴发流行，其中2014年的暴发流行是近20年来最大 的流行巨1。2016年全国累计报告登革热病例2

11、 049例，其中木地感染病例1 562 例，集中于福建省（921例），广东省（416例）,云南省（217例）£61o 2017 年8月深圳市龙华区报告了 1例输入性的疑似登革热病例。为了对该病例及时做 出实验室确诊，分析病毒的基因变异和种系进化特征，我们采集了患者的血液 标本进行登革热病毒血清学、病原学和分子生物学特征分析。1材料与方法1. 1样本来源 患者郑某于2017年7月22日越南出差，8月3日回国，8月6日在梅州市出现 发热等不适症状，当fi前往梅州市第二医院就诊，医院诊断为“急性肠胃炎”， 之后在家服药，但未见好转。8月8日回到深圳，8月9日到深圳市人民医院龙 华分院就诊，

12、医院诊断为“急性肠胃炎”，服药后未见好转，遂于8月10日到 深圳市人民医院龙华分院感染科就诊，医院初步诊断为疑似登革热。8月10 口， 深圳市人民医院龙华分院采集血样送深圳市龙华区疾病预防控制中心开展登革 热病毒核酸、登革热igm抗体、登革热igg抗体和登革热ns1抗原等项目的检 测。1. 2细胞株来源口纹伊蚊传代细胞（c6/36）,由深圳市疾病预防控制中心病原微生物所提供。取 200 u l 血清样本,用 roche 公司提供的 roche high pure viral nucleic acidkit试剂盒（货号:11858882001）提取病毒总核酸，严格按说明书进行操作。使 用商品化的

13、登革热病毒通用型核酸检测试剂盒（中山达安:20170207/2017-11-06）、登革热病毒i核酸检测试剂盒（中山达安:20170206/2017-11-02）,登革热病毒ig m抗体检测试剂盒（中山生 物:201701002/2018-01-11）,登革热病毒ig g抗体检测试剂盒（中山生 物:201701002/2018-01-11）,登革热病毒ns1抗原检测试剂盒（晋百慧生 物:20160801/2018-4-24）对所有样品进行检测。扩增反应体系和条件严格按照 试剂盒说明书操作和设置，在abi vii a7 dx版木的荧光定量pcr仪上进行。1. 4登革热病毒分离参照广东省登革热防控

14、专业技术指南（2015年版）中“登革热实验室检测 指引”的附件5。病毒的分离鉴定釆用real-time pcr方法。15登革热病毒e基因序列分析e基因的扩增参照广东省登革热防控专业技术指南（2015年版）中“登革热 实验室检测指引”的附件6。产物经琼脂糖凝胶电泳初步鉴定，目标条带送taka ra宝生物工程（大连）公司进行纯化和双向序列测定。序列使用blast i具进 行在线核昔酸序列同源比对，进化树构建与分析采用mega5. 0。2结果 2.1登革热病毒核酸和抗体检测 登革热病毒核酸和抗体检测结果见表1。2. 2登革病毒分离 成功从疑似患者血清标本（编号:17jb00855）屮分离获得登革热病

15、毒，命名为szlh_17jb00855_2017o 2.3 e基因扩增测序结果e基因的扩增参照广东省登革热防控专业技术指南（2015年版）中“登革热 实验室检测指引”的附件6。分别采用t d1f1和d1r1、d1f2和d1r2两对引物 进行扩增，琼脂糖凝胶电泳初步鉴定结果显示，成功获得两条目的产物，分别 为 1 010 bp 和 829 bpo2.4登革热病毒e基因序列测定及进化分析将目的产物送ta ka ra宝牛物工程（大连）公司进行纯化和双向序列测定。测 序结果经mega5. 0拼接后，最终得到长为1 485 bp dna序列。通过ncbt数据库 多序列在线比对（https:/blast.

16、 ncbi. nlm. nih. gov/blast.）,结果显示， szlh 17jb00855 2017毒株e基因与2007、2008及2011年越南分离毒株e基因 序列的覆盖率（query cover）在99%100%之间，见表2。从系统发生树的进化 分析结果显示，szlh_17jb00855_2017 与 vnbid-v1686/2007>vnbid-v1691/2007>vnbid-v3908/2008、vnbid-v3909/2008、vn09dx879/2011 亲缘性最近，与近年 来广东省各地市暴发的分离株亲缘性较远，见图1。表1疑似登革热病毒血清实验室检测结果ta

17、ble 1 resul ts of serum sample tested from the suspected dengue fever case卜载原表表2 sszzllhh_ 17jb00855_2017毒株e基因在ncbi数据库在线比对结果table2 e gene sequenee alignment in ncbi database of sszzllilil_17jb00855_2017下载原表图1 szzllhh_17jb00855_2017毒株e基因系统发生树进化分析fig. 1 e gene system evolutionary tree analysis of sszz

18、lliiii_17jb00855_2017 卜载 原图 _ _ 3讨论近年来多省份出现了登革热本地感染和局部暴发£1俎。广东省登革热流行形势 严峻，多个地级市出现本地疫情暴发，2013-2014年连续两年发生了登革热的 暴发流行回。深圳市10、中山市11、广州市12和梅州市等13-14地发生 了本地感染病例及局部暴发疫情。截至2017年8月26 h,越南2017年报告登 革热病例己经超过9万人，比去年同期增长了约60%(http:/outbreaknewstoday, com/cdc-i ssues-travel-noi ice-v ielnam-due-de ngue-outbre

19、ak-70536/)。本案例郑某于2017年7月22 口到越南出差，同年8 月3日回国，8月6日出现发热等不适症状，患者14天内到过疫区(越南)，有 流行病学史，流行病调查推断为一起输入性疫情。为了进一步印证流行病调查的 推断，实验室从患者血清中成功分离出登革热病毒，命名为 szlh_17jb00855_2017,以e基因序列研究作为基础，开展登革热病毒的溯源分 析。szlh_17jb00855_2017经real-time pcr鉴定，该毒株血清型为denv-lo测序获 得的e基因序列，经拼接后长为1 485 bpo通过ncbi数据库多序列在线比对 (https:/blast. nebi.

20、nlm. nih. gov/blast.),我们发现，它与越南 2007> 2008 及2011年分离毒株e基因覆盖率达99%100%。从在线比对结果推测， szlii_17jb00855_2017分离株极有可能來自于越南。为了证实这一推断，我们从 ncb1的数据库中，选取了近年来广东省6个地级市登革热的分离毒株，其中包 括广州、中山、珠海、江门、佛山和深圳，以及越南2007、2008及2011年分离 毒株，构建e基因系统进化发生树。结果显示，szlh_17jb00855_2017与越南 2007、2008及2011年分离株亲缘性最近，与近年来产东省各地级市(广州、中 山、珠海、江门、佛

21、山和深圳)暴发的分离株亲缘性较远。综上所述，现场流行病学资料和实验室分子遗传学分析都提示本案例报告的登 革热病例屈于输入性病例，输入地极有可能是越南。参考文献1 guzman m g, harris e. denguej. lancet, 2015, 385 (9966) :453-4652 wh0. the dengue strategic plan for the asia pacific region, 20082015eb/ol(2012一06一23) http:/wav. wpro. who, int/mvp/documcnts/dcn strat plan/cn3 brady 0 j, gething p w, bhatt s, et al. refining the global spatial limits of dengue virus transmission by evidence一based consensus. plo s ncgl trop dis, 2012, 6 (8) :cl7604 bhatt s, gething p w, brady 0 j, et althe global distribution and burden of denguejnature, 2013, 496 (7446) :504一5075 郭前方，崔国辉，方丹云，等.