牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和信号转导机制

1、牛磺酸抑制缺氧诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和信号转导机制收稿日期2013-10-16基金项目国家自然科学基金项目(81270113, 91339107)；研究生创新基金项目(yjscx2012-zz8hsd)；哈 尔滨科技创新人才项目(2013rfxxj092)；大庆重点项目 (scxz01011)通信作者*孙鹏，e-mail： sunpenghashangda126. com作者简介张晓丹，教授，e-mai 1: zhangxd85163. com摘要目的：探讨牛磺酸(taurine, tau)对缺氧诱 导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(pasmcs)增殖的影响，并且研 究细胞外信号调节激酶1/2

2、(erk1/2)通路是否参与了 tau 抑制pasmcs增殖的过程及可能的分子机制。方法：原代培 养大鼠pasmcs,选用第25代用于实验。tau给药浓度为80 mmol l-1, erk1/2 阻断剂(pd98059)浓度为 50 nmol l-1,给药时间24 ho体外嗟11 坐蓝比色法(mtt)、细胞免 疫荧光和蛋白免疫印记法检测牛磺酸在不同条件下对大鼠 pasmcs增殖能力的影响，将细胞分为4组：常氧组、常氧+tau 组、缺氧组、缺氧+tau组。蛋白免疫印记法检测erk1/2 通路是否参与了 tau抑制缺氧诱导pasmcs增殖的进程中。 实验分为5组：常氧组、缺氧组、缺氧+tau组、缺

3、氧 +tau+pd98059组、缺氧+pd98059组。结果：缺氧可诱导 pasmcs增殖，常氧情况下tau对pasmcs细胞增殖无影响， 常氧及缺氧条件下tau对pasmcs中肿瘤坏死因子-a(tnf-a )的表达无影响。tau可以逆转缺氧诱导的细胞增 殖核抗原(pcna) (p 1.4免疫荧光测pcna 6孔板中 放入盖玻片，细胞消化后均匀铺于6孔板的盖玻片上，细胞 生长密度适宜后给药，细胞给药时间结束后，pbs冲洗细胞, 4%多聚甲醛固定15 min后弃掉，再用pbs冲洗3次，每次5 mine加入0. 5% triton透化穿孔10 min, pbs洗3次，每 次5 mino加入3%bs

4、a, 37 °c下封闭30 min。pbs洗后6孔 板中每孔加入pcna抗4 £孵育过夜。第2天回收一抗， pbs洗5 min, 一共3次，6孔板中每孔加入100 nl cy3荧 光二抗，避光37 °c下孵育2 ho时间结束后pbs洗3次， 每次5 mine每孔加入100 u l dapi孵育15 min。pbs洗3 次，每次5 min。抗淬灭剂封片，置于荧光显微镜下观察。1. 5免疫蛋白印迹分析各组加药培养24 h后收集细 胞，预冷的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗细胞3遍，加入细胞裂 解液，冰上裂解15 min后刮取细胞，低温离心机4 °c下13 500 r

5、min-1离心15 min,取上清，釆用bca法测定蛋白 浓度。蛋白溶液按4 : 1比例加入5 x loading buffer, 95 °c 煮5 min, 8% sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，将蛋白转印到 nc膜上，转膜结束后，用5%脱脂奶粉封闭lh,加入1： 400 稀释的一抗4 °c孵育过夜。次日回收一抗，tbst洗膜液洗 膜4次，每次10 min,辣根过氧化酶标记的兔二抗、鼠二抗 孵育lh, tbst振荡洗膜4次，每次10 mine ecl显色5 min 后显影。曝光后x光片在quantity one软件中进行分析。1.6统计学分析 应用spss 6.0软件进行

6、统计学分析， t检验和方差分析，p 图6 tau对p-erkl/2表达的影 响（土 s，n=6）fig.6 effect of taurine on p-erkl/2 expression ofpasmcs （±s, n=6）tau相比，pd98059+tau组pcna表达下降最显著（p 参考文献1 ghofrani h a, voswinckel r, reichenberger f, et al. hypoxia and non-hypoxia-related pulmonary hypertention established and new therapiesj cardio

7、vasc res, 2006, 72： 30.2 oudit g y, trivier m g, khaper n, et al. taurine supplementation reduces oxidative stress and improves cardiovascular function in an ironoverload murine modelj. circulation, 2004, 109： 1877.3 hidemi nonaka, takeshi tsujino, yasuhiro watari , et al. taurine prevent the decrea

8、se in expression and secretion of extracellular superoxide dismutase induced by homocysteinej circulation, 2001, 104： 1165.4 hu s j, huang y w. effect of taurine on proliferation of rat vascular smooth muscle cellsj. chin j pharmacol toxicol, 1997, 11 (1)： 35.5 liao x b, zhou x x, li j m, et al. tau

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