第七章质谱-yudh

1、质谱法原理质谱法原理质谱学及技术发展的历史质谱学及技术发展的历史上世纪初，英国物理学家上世纪初，英国物理学家Thomson利用放电方法产生正离子，经磁场利用放电方法产生正离子，经磁场作用后，记录其谱线，获得第一张质谱图，并发现氖的两个同位素作用后，记录其谱线，获得第一张质谱图，并发现氖的两个同位素 22Ne 和和 20Ne。1918年美国年美国A.J. Dempster用电子轰击的方法，记录了离子的质荷比和用电子轰击的方法，记录了离子的质荷比和相对丰度；相对丰度；1919年美国年美国F.W. Aston制造了第一台精密质谱，并精确测量了制造了第一台精密质谱，并精确测量了50多种多种元素的同位素

2、及丰度，制出了第一张同位素表，并首次引入元素的同位素及丰度，制出了第一张同位素表，并首次引入“质谱质谱”概念；概念；1942年出现第一台商品质谱仪，标志着质谱学进入一个新的发展阶段；年出现第一台商品质谱仪，标志着质谱学进入一个新的发展阶段；1957年实现了年实现了气相色谱与质谱仪的联用气相色谱与质谱仪的联用，GC/MS将质谱法在将质谱法在有机分析中的应用推向一个新阶段；有机分析中的应用推向一个新阶段；60年代，有机质谱迅速发展，年代，有机质谱迅速发展，高分辩技术高分辩技术已达到实用阶段，已达到实用阶段，几乎同时出现了化学电离、场致电离、场解吸电离等技术；几乎同时出现了化学电离、场致电离、场解吸

3、电离等技术；70年代，生命科学的迅猛发展，给分子量测量的权威工具年代，生命科学的迅猛发展，给分子量测量的权威工具质谱提出挑战，将质谱提出挑战，将分子量大、热不稳定性的生物分子如蛋白分子量大、热不稳定性的生物分子如蛋白质、多糖等变成气相离子是质谱亟需解决的关键问题质、多糖等变成气相离子是质谱亟需解决的关键问题；80年代，出现新的年代，出现新的“软电离软电离”质谱技术质谱技术（如电喷雾质谱（如电喷雾质谱ESI、基质辅助激光解吸电离质谱基质辅助激光解吸电离质谱MALDI等），等），使得生物大分子使得生物大分子的测定成为可能的测定成为可能;同时解决了同时解决了LC/MS及及CE/MS的接口问题，的接口

4、问题，从而大大拓宽了质谱及其联用技术的应用范围。从而大大拓宽了质谱及其联用技术的应用范围。 1906年年Thomson获获Nobel物理奖物理奖 1986年年Paul获获Nobel物理奖物理奖1996年年Kroto等获等获Nobel化学奖化学奖2002年年Fenn,Tanaka获获Nobel化学奖化学奖质谱技术质谱技术 & Nobel奖奖Joseph John Thomson1906 Nobel Prize in Physics Francis William Aston1922 Nobel Prize in ChemistryWolfgang Paul1989 Nobel Prize

5、 in PhysicsJohn B. Fenn2002 Nobel Prize in ChemistryKoichi Tanaka2002 Nobel Prize in Chemistry Nobel Prize Winners for Mass Spectrometry质谱是重要的分析工具质谱是重要的分析工具 ,应用相当广泛应用相当广泛, 其特点可以概括为：其特点可以概括为：质谱法与其他主要分析方法灵敏度的比较质谱法与其他主要分析方法灵敏度的比较分析方法 检测灵敏度（g）NMR10-310-5IR10-610-7GC10-610-13UV10-610-7MS10-1110-128.1 质谱法

6、概述质谱法概述 化合物分子在真空条件下受电子流的化合物分子在真空条件下受电子流的“轰击轰击”或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时或强电场等其他方法的作用，电离成离子，同时发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质发生某些化学键有规律的断裂，生成具有不同质量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比（量的带正电荷的离子，这些离子按质荷比（m/z）的的大小大小被收集并记录的被收集并记录的图谱。图谱。外部能量外部能量AB+, ABC+, CD+, A+, B+, C+, D+ABCD+ABCD碎片离子碎片离子分子离子分子离子分子结构分子结构 离子离子计算机数据处理系统真空系统 加速区进样系统离子源质量

7、分析器检测器 2 2、质谱计框图、质谱计框图单聚焦质量分析器单聚焦质量分析器双聚焦质谱计双聚焦质谱计: :静电分析器静电分析器 + + 磁分析器磁分析器静电分析器由两个同心圆板组成，两圆板之间保持一静电分析器由两个同心圆板组成，两圆板之间保持一定的电位差定的电位差(E)。 加速后的离子通过加速后的离子通过静电场和磁场后静电场和磁场后, ,达到能量聚焦、方达到能量聚焦、方向聚焦和质量色散向聚焦和质量色散的目的，使仪器的的目的，使仪器的分辨率大大提高。分辨率大大提高。mmmmmR1121故在两峰质量数较小时，要求仪器分辨率越大。 静电分析器加在磁分析器之前。加速后的离子在静静电分析器加在磁分析器之

8、前。加速后的离子在静电分析器中电分析器中, , 受到外斥内吸的电场力受到外斥内吸的电场力( (zEzE) )的作用的作用, , 迫迫使离子作弧形运动。使离子作弧形运动。2RmvzE 静电分析器只允许具有特定能量的离子通过静电分析器只允许具有特定能量的离子通过, ,达到达到能量聚焦能量聚焦, ,提高仪器分辨率。提高仪器分辨率。V:V:加速电压加速电压. E: . E: 电位差电位差.v: .v: 速度速度. m: . m: 质量质量. .zVmv221结合结合 EVR2， 导出导出3、基本原理、基本原理质谱仪示意图质谱仪示意图离子在质谱仪中被电场加速。加速后其动能和位能相等离子在质谱仪中被电场加

9、速。加速后其动能和位能相等, 即：即：212mvzV m: 离子质量；离子质量；v: 离子速度；离子速度；z: 离子电荷；离子电荷；V: 加速电压加速电压被加速的离子进入磁分析器时，磁场再对离子进行作被加速的离子进入磁分析器时，磁场再对离子进行作用，让每一个离子按一定的弯曲轨道继续前进。用，让每一个离子按一定的弯曲轨道继续前进。其行进轨道的曲率半径决定于各离子的质量和所带电其行进轨道的曲率半径决定于各离子的质量和所带电荷的比值荷的比值m/z。离子动能产生的离心力离子动能产生的离心力(mv2/R)与由磁场产生的向心力与由磁场产生的向心力(Hzv)相等：相等：2mvHzvRR: 曲率半径曲率半径H

10、: 磁场强度磁场强度RHzvm22/2H Rm zV质谱的基本方程质谱的基本方程212mvzV12 units12 units0 units0 units质谱基本原理质谱基本原理质谱：称量离子质量的工具质谱：称量离子质量的工具12 units12 units12 units12 units质谱基本原理质谱基本原理质谱：称量离子质量的工具质谱：称量离子质量的工具8 9 10 11 12 13 14 8 9 10 11 12 13 14 12 units12 units12 units12 units质谱：称量离子质量的工具质谱：称量离子质量的工具8 9 10 11 12 13 14 15 161

11、2 units14 units质谱：称量离子质量的工具质谱：称量离子质量的工具12 units8 9 10 11 12 13 14 15 16massNumber of counts质谱图是以质荷比（质谱图是以质荷比（m/zm/z）为横坐标，以各（）为横坐标，以各（m/zm/z） 离子的相对强度（也称丰度离子的相对强度（也称丰度）为纵坐标构成）为纵坐标构成质谱：称量离子质量的工具质谱：称量离子质量的工具 质谱图由横坐标、纵坐标和棒线组成。谱图由横坐标、纵坐标和棒线组成。横坐标标明离子质荷比（横坐标标明离子质荷比（m/z）的数值，的数值，纵坐标标明各峰纵坐标标明各峰的相对强度，棒线代表质荷比的离

12、子。图谱中最强的一的相对强度，棒线代表质荷比的离子。图谱中最强的一个峰称为基峰，将它的强度定为个峰称为基峰，将它的强度定为100。丁酮的质谱图基峰：基峰： 离子强度最大的峰，规定其相对强度（离子强度最大的峰，规定其相对强度（RI）或相对丰）或相对丰度（度（RA）为）为100。精确质量：精确质量： 精确质量的计算基于天然丰度最大的同位素的精确原精确质量的计算基于天然丰度最大的同位素的精确原子量。子量。如：如： 1H 1.007825 12C 12.000000 14N 14.003074 16O 15.994915 CO、N2、C2H4 的精确质量依次为：的精确质量依次为： 27.9949、28

13、.0062、28.0313 （1） 分子离子分子离子 ：分子被电子束轰击失去一个电子形成的离子。分子被电子束轰击失去一个电子形成的离子。分子离子用分子离子用 M+ 表示，是一个游离基离子。表示，是一个游离基离子。在质谱图上，与在质谱图上，与分子离子相对应的峰为分子离子峰。分子离子相对应的峰为分子离子峰。分子离子峰的应用：分子离子峰的应用：分子离子峰的质荷比就是化合物的相对分子质量，分子离子峰的质荷比就是化合物的相对分子质量，所以，用质谱法可测分子量。所以，用质谱法可测分子量。（2）同位素离子）同位素离子含有同位素的离子称为同位素离子含有同位素的离子称为同位素离子。与与同位素离子相对应的峰称为同

14、位素离子峰。同位素离子相对应的峰称为同位素离子峰。（3）碎片离子）碎片离子分子离子在电离室中进一步发生键断裂生成的离子。分子离子在电离室中进一步发生键断裂生成的离子。（4）重排离子）重排离子经重排裂解产生的离子称为重排离子。经重排裂解产生的离子称为重排离子。其结构并非原来分子的结构单元。其结构并非原来分子的结构单元。（5）母离子与子离子）母离子与子离子任何一个离子（分子离子或碎片离子）进一步裂解生任何一个离子（分子离子或碎片离子）进一步裂解生成质荷比较小的离子。成质荷比较小的离子。前者称为母离子，后者称为子离子。前者称为母离子，后者称为子离子。（6）奇电子离子与偶电子离子）奇电子离子与偶电子离

15、子具有未配对电子的离子为奇电子离子。具有未配对电子的离子为奇电子离子。M+. ，A+. 这样的离子同时也是自由基，具有较高的反应活性。这样的离子同时也是自由基，具有较高的反应活性。无未配对电子的离子为偶电子离子。如：无未配对电子的离子为偶电子离子。如：D+（7） 多电荷离子多电荷离子失掉两个以上电子的离子是多电荷离子失掉两个以上电子的离子是多电荷离子。（8） 准分子离子准分子离子比分子量多或少比分子量多或少 1 质量单位的离子称为准分子离子，质量单位的离子称为准分子离子，如：如：(M+H) + 、( M-H)+不含未配对电子，结构上比较稳定。不含未配对电子，结构上比较稳定。（9）亚稳离子）亚稳

16、离子从离子源出口到达检测器之前裂解并被记录的离子称从离子源出口到达检测器之前裂解并被记录的离子称亚稳离子，其动能小于离子源生成的离子，以低强度亚稳离子，其动能小于离子源生成的离子，以低强度于表观质量于表观质量（跨（跨2 23 3质量单位）处记录下来，其质量单位）处记录下来，其m/zm/z一般不为整数。一般不为整数。 在质谱中，在质谱中，可提供前体离子和子离子之间的关系。可提供前体离子和子离子之间的关系。 离子在离子源的运动时间约离子在离子源的运动时间约10 6s数量级数量级, 寿命小于寿命小于 10 6s的离子在离子源内进一步裂解。离子从离子源到的离子在离子源内进一步裂解。离子从离子源到达检测

17、器的时间约为达检测器的时间约为10 5s数量级，离子寿命大于数量级，离子寿命大于10 5s，足以到达检测器。寿命在足以到达检测器。寿命在10 6s到到 10 5s的离子可产生亚的离子可产生亚稳离子。稳离子。真空系统真空系统Vacuum System进样系统进样系统Sample Inlet检测器检测器Detector数据处理系统数据处理系统Data System质量分析器质量分析器Mass Analyser离子源离子源Ionization Source8.1.1 质谱仪的组成质谱仪的组成Components of any Mass Spectrometer进样系统进样系统离子源离子源质量分析器质

18、量分析器检测器检测器8.1.2 质谱仪的主要性能指标质谱仪的主要性能指标1. 质量范围（质量范围（mass range） 质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。质谱仪所能测定的离子质荷比的范围。 四极质谱：四极质谱： 1000以内以内 离子阱质谱：离子阱质谱： 6000 飞行时间质谱：飞行时间质谱： 无上限无上限2. 分辨率（分辨率（resolution）分辨率分辨率R是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力。是指质荷比相邻的两质谱峰的分辨能力。若近似等强度的质量分别为若近似等强度的质量分别为M1及及M2的两个相邻峰正好分开，则的两个相邻峰正好分开，则质谱仪的分辨率定义为：质谱仪的分辨率定义为：R =

19、; 式中式中 M = ; M = M2 -M1M MM1+M22国际上：国际上：1）R10%：两峰间的峰谷高度为峰高的：两峰间的峰谷高度为峰高的10%时的测定值；时的测定值；2）一般难以找到两个质量峰等高，且重叠的谷高正好等于）一般难以找到两个质量峰等高，且重叠的谷高正好等于峰高的峰高的10%，则定义：，则定义：R = ; 式中式中 a为其中一峰的峰高为其中一峰的峰高5%处的峰宽处的峰宽; b为相邻两峰的中心距离为相邻两峰的中心距离M Mb a低分辨率质谱仪：低分辨率质谱仪： R 50 1）的分子离子峰所需）的分子离子峰所需的样品量。的样品量。8.1.3 质谱图质谱图横坐标：质荷比横坐标：质荷

20、比 (m/z)纵坐标：纵坐标：相对丰度相对丰度(最强峰的强度定为最强峰的强度定为100%)1008060402020CCH3O7710577105 CO120(M+)5143406080100120m/z相对丰度/(%) 苯乙酮的质谱图 苯乙酮的质谱图苯乙酮的质谱图 8.2 离子化方法离子化方法8.2 离子源离子源（Ionization Source）电子轰击电离（电子轰击电离（electron impact ionization, EI）化学电离（化学电离（chemical ionization, CI）场电离（场电离（field ionization, FI）场解吸（场解吸（field d

21、esorption, FD）快原子轰击（快原子轰击（fast atom bombardment, FAB）基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离（matrix-assisted laser desportion ionization, MALDI）电喷雾电离（电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）大气压化学电离大气压化学电离（atmospheric pressure chemical ionization, APCI）离子离子极性极性非极性非极性分子量分子量 (Da)EI 或或 CIESI或或MALDIAPCIThermosprayP B各种离子化方法的使用范

22、围各种离子化方法的使用范围 选择的依据选择的依据挥发性挥发性 热稳定性热稳定性 极性极性 要求取得的要求取得的结构信息结构信息 8.2.5 基质辅助激光解吸电离基质辅助激光解吸电离 （matrix-assisted laser desportion ionization, MALDI） 在一个微小的区域内，在极短的时间间隔，激光可对靶物在一个微小的区域内，在极短的时间间隔，激光可对靶物提供高的能量，对它们进行极快的加热，可以避免热敏感的化合提供高的能量，对它们进行极快的加热，可以避免热敏感的化合物加热分解物加热分解。MALDI的方法：将被分析化合物的溶液和某种基质溶液相混合。的方法：将被分析化

23、合物的溶液和某种基质溶液相混合。蒸发掉溶剂，则被分析物质与基质形成晶体或半晶体。用一定波蒸发掉溶剂，则被分析物质与基质形成晶体或半晶体。用一定波长的脉冲式激光进行照射。基质分子能有效地吸收激光的能量，长的脉冲式激光进行照射。基质分子能有效地吸收激光的能量，并间接地传给样品分子，从而得到电离。并间接地传给样品分子，从而得到电离。优点：优点：1）使一些难于电离的样品电离，且无明显的碎裂，从而得到）使一些难于电离的样品电离，且无明显的碎裂，从而得到完整的被分析化合物分子的电离产物；完整的被分析化合物分子的电离产物；2）特别适用于与飞行时间质谱相配（）特别适用于与飞行时间质谱相配（MALDI-TOFM

24、S）。）。通过激光束与固体样品分子的作用是其产生分子离子和具有结构信通过激光束与固体样品分子的作用是其产生分子离子和具有结构信息的碎片；所研究的是结构较为复杂、不易气化的大分子。息的碎片；所研究的是结构较为复杂、不易气化的大分子。采用固体基质以分散被分析样品是采用固体基质以分散被分析样品是 MALDI 技术的主要特色和创新技术的主要特色和创新之处。基质的主要作用是作为把能量从激光束传递给样品的中间体。此之处。基质的主要作用是作为把能量从激光束传递给样品的中间体。此外，大量过量的基质（基质：样品外，大量过量的基质（基质：样品=10 000：1）使样品得以有效分散，）使样品得以有效分散，从而减少被

25、分析样品分子间的相互作用。从而减少被分析样品分子间的相互作用。基质的选择主要取决于所采用的激光波长，其次是被分析对象的基质的选择主要取决于所采用的激光波长，其次是被分析对象的性质。性质。Matrix-assisted Laser Desorption Ionization (MALDI)1. Sample is mixed with matrix (X) and dried on plate;2. Matrix molecules absorb pulsed laser light and are rapidly heated, vaporized and ionized;3. Sample

26、molecules (M) are ionized by proton transfer from decomposing matrix molecules: XH+ + M MH+ + X.基质的作用基质的作用基质的作用是吸收激光能量并使被测分子分离成单分子状态，使基质的作用是吸收激光能量并使被测分子分离成单分子状态，使其发生解吸电离。选择基质时，要求样品应能均匀地分散于基质其发生解吸电离。选择基质时，要求样品应能均匀地分散于基质中，基质应能为样品提供质子。较常用的基质有芥子酸、中，基质应能为样品提供质子。较常用的基质有芥子酸、2，5二二羟基苯甲酸、羟基苯甲酸、2氰基氰基4羟基肉桂酸、羟基肉

27、桂酸、3吲哚丙烯酸、蒽三酚吲哚丙烯酸、蒽三酚等。等。基质的选择是得到优质谱图的关键。样品制备、基质溶液配制及基质的选择是得到优质谱图的关键。样品制备、基质溶液配制及两者混合后能共同结晶为最好的操作条件，这些因素对灵敏度和分两者混合后能共同结晶为最好的操作条件，这些因素对灵敏度和分辨率有明显的影响。辨率有明显的影响。Advantages and disadvantages of Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization (MALDI)AdvantagesDisadvantages Practical mass range of up to 300

28、kDa. Species of much greater mass have been observed using a high current detector; Typical sensitivity on the order of low femtomole to low picomole. Attomole sensitivity is possible; Soft ionization with little to no fragmentation observed; Tolerance of salts in millimolar concentrations; Suitable

29、 for the analysis of complex mixtures. matrix background, which can be a problem for compounds below a mass of 700 Da. This background interferences is highly dependent on the matrix material; possibility of photo-degradation by laser desorption/ionization; acidic matrix used in MALDI my cause degra

30、dation on some compounds. 8.3.2 飞行时间质谱计飞行时间质谱计（time of flight, TOF ）用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，用一个脉冲将离子源中的离子瞬间引出，经加速电压加速，它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最它们具有相同的动能进入漂移管，质荷比小的离子具有最快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到快的速度因而首先到达检测器，质荷比大的离子则最后到达检测器。达检测器。Ion SourceDrift RegionDetectorReflection图1-10 1-10 配离子反射镜的飞行时间质谱示意图配离子

31、反射镜的飞行时间质谱示意图优点：优点：1）检测离子的质荷比范围非常宽；）检测离子的质荷比范围非常宽；2）特别适合于与脉冲产生离子的电离源（）特别适合于与脉冲产生离子的电离源（MALDI-TOF）；）；3）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；）灵敏度高，适合于作串联质谱的第二级；4）扫描速度快，适合研究极快过程；）扫描速度快，适合研究极快过程；缺点：缺点：分辨率随质荷比的增加而降低。分辨率随质荷比的增加而降低。飞行时间质谱计飞行时间质谱计（time of flight, TOF ）8.3.3 四极四极质量分析器（质量分析器（Quadrupole Mass Analyzer）+由四跟平行的棒状电极组成而得名。与由四跟平行的棒状电极组成而得名。与扇型磁场的质量扇型磁场的质量分析器的原理完全不同。分析器的原理完全