转Bt基因抗虫水稻探究进展

1、转bt基因抗虫水稻探究进展摘要：介绍了 bt基因及转肮基因抗虫水稻的作用机理， 综述了转bt基因水稻的研究概况，分析了转肮水稻的生物 安全性，并展望了 bt水稻的发展趋势，以期为bt水稻的安 全性评价及大规模商业化种植提供参考。关键词：水稻；bt基因；转基因；抗虫中图分类号：s511文献标识码：a doi编码：10. 3969/j. issn. 1006-6500.2012.06.003水稻(oryza sativa)是世界上最重要的粮食作物之一，全球近半数人以稻米为食。20012025年，世界对水稻的需求量大致每年增加1%，相当于这一时期亚洲人口的增长率。世界上水稻的种植范很广，其中中国是最

2、大的产稻国,其水稻产量占世界稻米总产量的1/3e1,因此，水稻种植带 来的产值在我国国民经济中占有十分重要的位置。与此同时，水稻同样也是受到害虫侵害最为严重的农作物之一2。长期以来，为害我国水稻的主要害虫有螟虫(稻纵卷叶螟、 二化螟、三化螟)和稻飞虱，主要病害有稻瘟病、白叶枯病、 纹枯病等3,每年因虫害造成水稻产量损失约为10%4。 在过去的几十年中，化学防治一直是水稻害虫防治的主要方 法，但在减轻害虫危害、提高水稻产量的同时也产生了新的 问题。化学杀虫剂的长期使用造成了严重的环境污染、生态 的失衡、生产成本提高、水稻品质下降以及害虫本身产生抗 药性等问题。随着植物分子生物学技术和基因工程技术

3、的飞 速发展，有大量文献报道，培育自身具有高抗虫性的水稻已 成为现实5-9 o1 bt基因及转肮基因抗虫水稻的作用机理1. 1 bt基因的简介bt基因即苏云金芽胞杆菌(bacillus thuringiensis, 简称bt)基因，由于其具有杀虫效果好、安全性髙、高效等 优点，已成为现今世界上应用最为广泛和最有应用前景的抗 虫基因。首次发现苏云金芽胞杆菌是在1902年，发现该菌 的学者是日本生物学家shigetane ishiwatari；再次分离出 该杆菌是在1911年的德国苏云金省，分离出该杆菌的学者 是ernst berline,并将该菌命名为苏云金芽胞杆菌10-11。 苏云金芽砲杆菌是

4、一种分布极其广泛的革兰氏阳性细菌，其 主要的杀虫活性成分杀虫晶体蛋白(insecticidalcrystal proteins, icp),也称为6-内毒素，是苏云金芽 鞄杆菌在芽胞形成过程中产生的。典型的icp由两部分组成, n端的活性片段和c端的结构片段，编码杀虫晶体蛋白的基 因通称为bt或cry基因。许多icp的氨基酸序列存在不同 程度的同源性，由crickmore等人组成的bt基因命名委员 会在1995年召开的无脊椎动物病理会年会上提出了以杀虫 蛋白氨基酸序列同源性为唯一标准的分类命名体系。同源性 在45%以下，为第一等级，用阿拉伯数字表示；同源性在45% 78%之间，为第二等级，用大

5、写英文字母表示；同源性在78% 95%之间，为第三等级，用小写英文字母表示；同源性在95% 以上，为第四等级，用阿拉伯数字表示，例如crylaal基因 12 o 自 1981 年 schnepf 等13首次克隆出 cry (crystal protein gene)基因以来，新的bt基因不断地被发现，截 止2012年8月，bt基因已达到73个大类，总计667个基因 序列14。这些杀虫晶体蛋白可作用于鳞翅目、双翅目、鞘 翅目等靶标昆虫和线虫，还能溶解细胞。1.2转bt基因水稻的抗虫机理经转基因技术将bt毒蛋白导入水稻后，一般认为bt毒 蛋白的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入和 孔洞或

6、离子通道的形成5个环节15 o研究表明，bt毒蛋白 可溶解于ph值大于12或ph值小于9. 5并加有蔬基试剂的 碱性溶液中16。鳞翅目昆虫幼虫中肠的ph值呈碱性，有 利于肮 毒蛋白的溶解，这也是苏云金芽砲杆菌对鳞翅目昆 虫有高效毒杀作用的原因之一。bt毒蛋白的重要杀虫成分 icp自身没有生物活性，又名原毒素(protoxin),通过昆 虫的取食可在昆虫中肠的碱性环境中被溶解，溶解的bt毒 蛋白被中肠蛋白酶水解为毒素核心肽段，这些活力肽段能与 中肠上皮的特异性受体专一性结合，进而毒蛋白插入细胞膜 中形成孔洞或离子通道，使膜的完整性遭到破坏，引起细胞 渗透失衡，细胞膨胀并溶解，最终导致昆虫死亡。对

7、bt毒蛋白导致害虫死亡的组织病理学研究表明，二 化螟5龄幼虫取食转(crylab)基因抗虫水稻后，中肠上 皮细胞中的细胞器会发生很大的变化，如线粒体和内质网的 形态会发生明显变化，在病变的过程中会出现粗糙内质网的 肿胀和核糖体脱落等现象。与对照相比，取食bt水稻后的 二化螟幼虫肠道内弱碱性类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶的 活性呈下降趋势，而强碱性类胰蛋白酶的活性则呈上升趋势 17。在正常的稻纵卷叶螟3龄和5龄幼虫肠道内，中肠上 皮柱状细胞顶部的微绒毛数量比较多，细胞质均匀，细胞 器丰富。当这些稻纵卷叶螟幼虫取食bt水稻后，柱状细胞 的微绒毛有脱落现象，且随着取食时间的增加，中肠上皮细 胞中的细胞质

8、透明化，细胞器的数量减少18 o2转bt基因抗虫水稻概况转基因水稻是继转基因大豆、玉米、棉花和油菜等之后 又一个备受国际重视且发展显著的产业。转bt基因水稻是 利用转基因技术将苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白基因作为外源 基因导入水稻获得的，对鳞翅目害虫(如稻纵卷叶螟、二化 螟和三化螟等)具有良好的抗性19。虽然发现了上百种bt 基因，但是仅有很小的部分被导入水稻中进行抗虫性测定。 转bt基因水稻最初常以cryla类为主，如crylab、crylac、 融合基因cryla (b) /cryla (c) 20等,现在bt抗虫水稻 无论从方法上还是成果上均已取得了巨大进展。自20世纪80年代中期以来，研究人

9、员运用不同的转基 因技术获得了不同种类的bt抗虫水稻。杨虹等5报道了通 过聚乙二醇(peg)法将bt基因导入水稻，谢道昕等21通 过花粉管通道技术把bt基因成功地导入水稻中，fujimoto 等7采用电激法将通过修饰的cry 1 ab基因导入粳稻，首次 得到了高表达bt蛋白的水稻植株，具有良好的抗虫性。 wtinn、ghareyazie、许新萍等研究者分别利用基因枪法将 肮基因成功地导入水稻中获得了转基因植株，且抗虫性较好 8, 22-24 ； chan、cheng、项友斌等分别报道了用农杆菌 转化法将bt基因导入水稻，获得了可育的、抗虫性良好的 转基因植株9, 25-28 o随着水稻遗传转化

10、技术的不断成熟, 基因枪法和农杆菌介导的转化方法成为目前转基因水稻中 常用的两种方法。随着对转bt基因抗虫水稻研究的不断深入，人们发现转单价cryla类抗虫水稻植株的抗虫谱单 一，害虫对转基因植株耐受性增强。为了解决这些问题，并 且使水稻能够高抗和多抗，增强bt水稻的抗虫性，国内外 的研究者们开始试验运用除cryla类以外的其它基因，随后 陆续报道了运用经人工改造合成的bt抗虫基因，如用改造 的cry2a. crylb、crylc等培育的对水稻螟虫具有不同程度 抗性的水稻29-34。同时，协同转化两个或多个抗性基因 的研究也在进行，如maqbool等35首次将crylac和cry2a 两个bt

11、基因转入水稻中；bashir等36将crylac和cry2a 协同导入釉稻中，得到的转双价基因植株对三化螟和稻纵卷 叶螟具有高抗性。卫剑文等32采用基因枪法把bt基因 cry 1 ab与大豆胰蛋白酶抑制剂基因（sbti）共同导入到优良 釉稻中，获得的植株对稻纵卷叶螟的抗虫性增强，李永春等 37通过农杆菌介导法把双价抗虫基因crylac和cpti （肛 豆胰蛋白酶抑制剂）转入粳稻中，得到了对二化螟高毒性的 植株。中国科学院huang等38得到了转crylac和经修饰 的cpti双价基因水稻，对大螟、二化螟以及稻纵卷叶螟有 高抗性，已进入环境释放阶段。沈志成等39将融合cry 1 ab /vip3

12、基因导入水稻，得到对二化螟和稻纵卷叶螟抗性良好 的植株，冯道荣等40首次运用基因枪法把含有多个抗虫抗 病基因（bt+pinii+bar）的载体转入水稻，并得到了既抗虫 又抗病的植株。maqbool 41在2001年又研究了转 cry 1 ac+cry2a+gna三价基因的籾稻，结果表明它们对水稻害 虫的抗性显著，ramesh等42把人工合成的cry 1 ab /crylac 融合基因和gna基因一同转入粒稻，获得的转基因株系对鳞 翅目和同翅目害虫均表现出显著抗性。全球转基因水稻的研究发展迅速，实验中应用最为成功 的抗虫基因是对鳞翅目害虫有显著控制作用的肮 基因。转 bt基因抗虫水稻是当前研究最

13、为成熟和最接近实现商品化 的转基因水稻品种之一43。2000年以来，美国先后批准6 个抗除草剂和药用转基因水稻，伊朗批准了1个转基因抗虫 水稻商品化种植；加拿大、墨西哥、澳大利亚、哥伦比亚这 4国批准了转基因水稻进口，允许食用44。2009年，我国 为转基因抗虫水稻品系'华恢1号'和'bt汕优63'发放 了安全证书，它们是由华中农业大学培育的高抗鳞翅目害虫 转基因水稻。科学家将人工改造合成的bt杀虫蛋白融合基 因crylab/crylac转入水稻恢复系'明恢63',培育出抗虫 水稻"华恢1号，。中国是世界上第三个批准转基因水稻的 国家，

14、将成为世界上种植转基因水稻面积最大的国家。3转bt基因抗虫水稻的安全性水稻作为百姓的主粮，它的产业发展一直备受人们的关注和重视。转基因水稻的出现，可以减少水稻病害虫的发生, 减少农药用量和环境污染，节省投入成本，解决人类粮食紧 张问题。bt作为外源基因导入水稻所产生的安全性问题已成 为社会广泛关注的热点。转bt基因水稻的安全性包括食品 安全和生态安全。转基因稻米是人们直接食用的产品，关系 到人类的生命健康和安全。鳞翅目害虫等靶标昆虫的中肠上 皮细胞含有肮蛋白的特异性受体，而人类肠道上皮细胞没 有该蛋白的结合位点，因此bt蛋白不会对人造成伤害。在 营养学评价方面，转基因水稻与非转基因对照水稻在主

15、要成 分、微量营养成分以及抗营养因子等方面都没有生物学意义 上的差异。在毒理学评价方面，转基因稻米对大鼠进行90 d 喂养试验、慢性毒性试验，结果表明bt稻米对哺乳动物是 安全的45。转bt基因水稻的生态安全性也是人类关注的问题，转 基因水稻的种植是否会产生基因漂流，以及是否会对非靶标 性昆虫、生物多样性以及土壤环境等造成影响都需要进一步 深入研究。现有的研究表明，转bt基因抗虫水稻对稻田生 态系统是安全的；bt水稻对稻田节肢动物群落影响明显弱于 化学杀虫剂，用bt水稻防治害虫比用化学杀虫剂更有利于 保持稻田生物群落的稳定性和保护稻田中害虫的天敌。转肮 基因水稻对土壤微生物和酶活性有一定的影响

16、，关于这方面 的研究应该在不同生态区开展长期的定位监测和评价。bt水 稻对人类、环境、生态的安全性还需要多层次、多角度地进 行深入和持久的研究。4展望转基因抗虫水稻经过20多年的发展，已硕果累累且前 景广阔。在生物技术快速发展的今天，我国作为一个农业大 国，应力争走在转基因育种技术领域的最前沿。面对人口众 多的基本国情，我们在保证粮食产量的同时要保证粮食安 全。目前，水稻转基因技术已成熟，但距大规模运用遗传工 程技术改良水稻品种、生产转基因水稻还有遥远的距离。转 基因抗虫水稻虽然在安全性研究方面已取得了一定成就，但 还存在许多未知领域。因此，加快建立关于转基因水稻安全 性评价体系的标准是一项刻

17、不容缓的工作。转基因抗虫 水稻为防治害虫提供了一条经济便捷的途径，它必将带来大 规模的商品化种植，然而对它的安全性还需要从对人类、环 境和生态等方面进行长期和深入的研究。参考文献：1 maclean j l, dawe d c, hardy b, 等.水稻知 识大全m.福州：福建科学技术出版社，2003.2 王丽冰，刘立军，颜亨梅.转bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策j.生命科学研究， 2009,13 (2)：182-188.3 zhang q. strategies for developing green superrice j. proc natl acad sci usa,

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