酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究.doc

1、酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究袁某某（西北农林科技大学 陕西杨凌)摘要采用自溶法从酵母中提取蔗糖酶，即在一定PH和适当的温度下，利用组织细胞内自身的酶系统将细胞破碎再通过乙醇的分级与透析,得到纯化的酵母蔗糖酶。本实验也通过考马斯亮蓝G250染色法,测定蔗糖酶的活力和蛋白质浓度,对蔗糖酶的性质进行了研究。关键词蔗糖酶，分离提取，酶活力，蛋白质含量1 引言自1860年Bertholet从啤酒酵母(Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来,它已被广泛地进行了研究。蔗糖酶(invertase）（D-呋喃果糖苷果糖水解酶）（EC.3。2.1。26）特异地催化非还原糖中的呋喃果

2、糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖,也能催化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖.2 材料与方法2.1 实验材料高活性干酵母粉、DEAE纤维束DE23、0。2mol/L TrisHCL缓冲液、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、葡萄糖、水杨酸、0。4mol/L NaOH溶液2。2 实验方法2.2.1 蔗糖酶的提取与部分纯化 将15g高活性干酵母粉倒入250ml烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入1.5g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀，再于35恒温水浴中搅拌30min。抽提补加蒸馏水30ml，搅匀，盖好,于35恒温过夜，8000r/min离心10min，

3、弃沉淀及脂层，的粗级分。预先将恒温水浴调到50，将盛有粗体级分的离心管稳妥地放入水浴中，不断轻摇离心管保存30min。取出离心管，于并于中迅速冷却，4，10000r/min， 离心10min.取上清液，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为热级分）.将热级分转入小烧杯中，放入冰盐浴，逐滴加入等体积预冷至20的95乙醇,同时轻轻搅拌30min，再冰盐浴10min，以沉淀完全。4,10000r/min, 离心10min,弃去上清液，并滴干，沉淀保存于离心管中,盖上盖子，然后将其放入冰箱中冷冻保存，即醇级分。2。2.2 酶活性及酶活力影响因素的研究 采用水杨酸试剂显色法，通过测定反应后

4、样品中还原糖的量来确定酶活力。（1） 标准曲线的制作 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号01234567891020mmol/L葡萄糖/ml0.00.10.20。30.40。50。60。70.80.91.0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00.90。80.70。60.50.40.30.20.10。0水杨酸试剂/ml22222222222沸水浴5min，流水冷却，定容至15ml00.1020。1610.2150。2620.3330.3530。3850.4120.4400。479(2) 反应时间的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.2

5、mol/L蔗糖/ml0.20。20。20.20。20。20.20.20.20。2乙酸缓冲液pH5。0/ml0。20。20.20。20。20.20。20.20。20。2/ml0.20.20.20.20。20。20。20.20.20。60.4mol/L NaOH/ml1。0由加酶开始计时蔗糖酶/ml0。40.40.40。40.40.40。40。40.4反应时间/min0136101520304050反应时间到后立即向210管加入1ml 0。4mol/L NaOH终止反应.并向各管加入2ml 3，5-二硝基水杨酸,沸水浴准确煮5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0。1160.1870。314

6、0.3940.3230.7170。8321.0041.3290.016生成还原糖mol/ml0.1620。3730。7510。9890.7781。9502。2922.8033.770（3） pH值的影响 取做好编号的试管,按下表进行实验。管号123456780.2mol/L蔗糖/ml0.20。20。20。20.20.20.20。2乙酸缓冲液pH3。54。04.55.05.56。0pH梯度/ml0.20。20。20.20.20。2/ml0.80。20.4mol/L NaOH/ml1。0蔗糖酶/ml0。60.60.60.60.60.60。660准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.

7、01.01。01。01.01.01.0水杨酸试剂/ml2.02。02.02.02。02。02.02。0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0。0211.0331。0221.0691。3031。2621。2140。837生成还原糖mol/ml2。8902。8572。9973。6933.5713.4282。307（4） 温度的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号123456789100.2mol/L蔗糖/ml0。20。20。20。20。20。20.20。20.20。2乙酸缓冲液pH5。0/ml0。20.20。20。20.20。20。20.20.20.2/ml0。60.60.6

8、0。60.6蔗糖酶/ml0.60。60.60.60。6温度/40405050606070708080反应时间/min0136101520304050各温度反应10min后，每管加入1ml 0。4mol/L NaOH终止反应.并向各管加入2ml 3，5二硝基水杨酸,沸水浴准确煮5min后,迅速流水冷却，用水定容至15ml0.963-0.0170.702-0.0201。194-0。0150.536-0.0030.5420。013生成还原糖mol/ml2。68141。9053。3681.4111。429（5） 底物浓度的影响 取做好编号的试管，按下表进行实验.管号123456780。5mol/L蔗糖

9、/l02030406080100200/l600580570560540520500400乙酸缓冲液pH5。0/l200200200200200200200200蔗糖酶/ml20020020020020020020020060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1.01。01。01。01.01.01.01。0水杨酸试剂/ml2。02。02.02。02。02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.0500。1690。2040.2690。3540。3720。3900。545生成还原糖mol/ml0.3200。4240.6170.8700.9240.977

10、1。438（6） 脲对蔗糖酶的抑制作用 取做好编号的试管，按下表进行实验.管号123456789100。5mol/L蔗糖/l0000202020203030蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5。0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l010020030001002003000100/l60050040030058048038028057047060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01.01.01.01.01.01.01。01.0水杨酸试剂/ml2.02.02。02。02。0

11、2。02。02.02.02.0沸水浴5min后，迅速流水冷却,用水定容至15ml0。0460。0600.0550。0540.3160.3140。2650。1820。3870。306生成还原糖mol/ml0。7570.7510。6050.3580。9680。727管号1112131415161718192021220.5mol/L蔗糖/l303040404040606060608080蔗糖酶/l200200200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5.0/l2002002002002002002002002002002002004mol/L脲/l200200010

12、020030001002003000100/l37027056046036026054044034024052042060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01。01。01。01。01。01。01.01。01.01。0水杨酸试剂/ml2.02.02。02。02。02。02。02.02。02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15ml0.2280.2050.4600。3760。3610.3020.6640.5620.4680.4331.0880.916生成还原糖mol/ml0.4950。4271。1850。9350.8920。7151.7921.4

13、891.2091.1053。0532。542管号232425262728293031320.5mol/L蔗糖/l8080100100100100200200200200蔗糖酶/l200200200200200200200200200200乙酸缓冲液pH5.0/l2002002002002002002002002002004mol/L脲/l20030001002003000100200300/l32022050040030020040030020010060准确反应10min0.4mol/L NaOH/ml1。01。01。01.01。01。01。01.01。01。0水杨酸试剂/ml2。02.02

14、.02.02。02.02.02。02。02.0沸水浴5min后,迅速流水冷却，用水定容至15ml0.6880.4951.0670。8910.6850.6021。0290.9800。7370。676生成还原糖mol/ml1.8631。2892.9912。4671.8551.6082。8782。7322。0091。8282。2.3离子交换柱层析纯化蔗糖酶(1）以DEAE纤维素DE23为吸附剂，处理好后加少量水边搅拌边倒入层析管中，缓慢沉降，并以100ml 0。02mol/LpH7.0Tis-HCL缓冲液过柱,调整流速为5ml/2min.平衡后,采用100ml 0。02mol/LpH7.0Tis-H

15、CL缓冲液和100ml（含0。2ml/LNaCL）0。02mol/LpH7.0TisHCL缓冲液，进行线性梯度洗脱.（2)用3ml缓冲液醇级分,留取1ml用于测酶活力及蛋白含量.剩余的4000r/min离心1min,除去不溶物，取上清液小心地加到层析柱上（上样前在柱床表面加一张同一大小的柠檬纸)。开始洗脱后，连续收集洗脱液,每试管收集10ml。每试管分别取0。6ml洗脱液，置于不同的试管中,分别加入0。2ml 0。2mol/L蔗糖，0.2ml 0。2mol/L pH为5。0的乙酸缓冲液及2ml水杨酸，沸水浴5min后观察各试管中溶液颜色，将颜色最深的四个试管对应的洗脱液试管中的溶液合并。(3）

16、将合并的洗脱液浓缩后取1ml用于测酶活力及蛋白含量(柱级分），剩余的使用PEG2000透析浓缩液用于进一步离子交换柱层析纯化.按步骤（1）（2）重复实验（注意上样之后立即收集洗脱液）,得柱级分.2.2.4蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定各级分蛋白质含量的测定（1） 标准曲线的制作取做好编号的试管，按下表进行实验.管号012345678910牛血清蛋白/ml0。00.10.20.30.40。50。60。70。80。91。0牛血清蛋白/g0.020406080100120140160180200/ml1。00。90.80.70.60。50.40。30.20.10。0考马斯亮蓝G-250/ml55

17、5555555550.000.1110.2640。3400.5260.7080。8600。9601。1461.2081。297（2） 各级分蛋白质含量的测定各级分按以下稀释倍数稀释：粗级分-5倍；热级分-5倍；醇级分-10倍;柱级分-10倍。 取做好编号的试管，按下表进行实验。管号0级分级分级分级分12345678酶液/ml011111111/ml100000000加入考马斯亮蓝G-250各5m，混匀后静置2min后在595nm测吸光度1.2041。2000。8630。8530.4170.3210。1420。147平均值1。2.20.8580.3690。1445蛋白质浓度g/ml29。7462

18、1.0029。1913.768酶活力的测定 采用水杨酸试剂显色法,通过测定反应后样品中还原糖的量来确定酶活力.（1）标准曲线的制作管号01234567891020mmol/葡萄糖/ml0.00。10。20。30。40。50。60.70.80.91。0葡萄糖/mol02468101214161820/ml1.00。90。80。70.60.50。40.30.20.10.0水杨酸试剂/ml22222222222沸水浴5min，流水冷却,定容至15ml00。1020.1610。2150.2620.3330。3530.3850.4120.4400.479（2） 各级分酶活力大小的测定取做好编号的试管，按

19、下表进行实验。管号对照级分级分级分级分级分123456789101112酶液/ml0.00。60。60。60.60.60.60.60。60.60.6/ml0.6乙酸缓冲液pH5。0/ml0。20.20。20。20.20.20。20。20。20.20.20.4mol/L NaOH/ml10。2mol/L蔗糖/ml0.20。20。20。20。20。20。20。20.20.20.2加入蔗糖，立即摇匀开始计时,室温反应10min,反应后向312试管中加入NaOH终止反应水杨酸试剂/ml2。02.02。02.02.02。02.02。02.02.02。02。0沸水浴5min后，迅速流水冷却，用水定容至15

20、ml0.7200.6810.5560.6250。2400。2230.1270.1500.1380.135生成还原糖mol/ml1.9581。8431。4711.6760。5310.4800.1950.2630.2280。2192。2。5 分离产物的SDS-PAGE电泳检测分离胶（ml）浓缩胶（ml）H2O8。27。35Acr-Bis6.681。3分离胶缓冲液pH8.85.0浓缩胶缓冲液pH6.81。2510%SDS0.10。110%APS0.070.06TEMED(最后加)0。040。1将玻璃板洗净、晾干、固定。按照实验要求,配制12%的分离胶,迅速注入玻璃板夹层中，上部用乙醇封面，保持胶面平

21、整。待分离胶聚合后，配制5%的浓缩胶，倒去分离胶表面的乙醇，然后灌入浓缩胶，插入点样梳.拔出样品梳后加入缓冲液，点样取10l标准蛋白溶解液于EP管内，加入10l2倍样品缓冲液，上样量为20l；取10l样品（五个级分），再加入10l2倍样品缓冲液，上样量为20l。接通电源进行电泳。电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶,并切角以作记号(戴手套，防止污染胶面）。加入染色液,染色过夜。将染好色的凝胶板直接放入脱色液中脱色，并拍照.3 数据分析与结果3.1 吸光度对葡萄糖浓度做标准曲线：3.1。1 反应时间对产物浓度的影响分析由图可知，在一定范围内反应时间越长，产物浓度越高.反应初速度V（还原糖）=0

22、。3305mol/ml3.1。3 pH值对酶促反应影响分析 由图可计算出当pH值为3.6477时，生成还原糖量最多，即酵母蔗糖酶最适反应pH值为3。64777。3。1.4 温度对酶促反应影响分析由图可计算出,当温度为49时，生成还原糖量最多，即酵母蔗糖酶最适反应温度为49.3.1。5 底物浓度对酶促反应的影响分析由图可计算出=2。733.1.6 脲对蔗糖酶酶促反应的影响分析当脲素浓度为0时1/Vmax=1。1083 Km/ Vmax =8。5677故Km=7。911 Vmax=0.902当脲素浓度为26.67（umol/ml)时1/Vmax=1.399 Km/ Vmax =15。494故Km=-11.075 Vmax=0。715当脲素浓度为53。33（umol/ml)时1/Vmax=3.4956 Km/ Vmax =22。474故Km=6。429 Vmax=-0.286当脲素浓度为80(umol/ml）时1/Vmax=1。046 Km/ Vmax=18.