β肌动蛋白的克隆与鉴定

1、p肌动蛋白的克隆与鉴定王鹏邓志康石绮峰刘允刘准刘斌摘要：肌动蛋白是在真核生物中普遍存在的一种古老的蛋內质之一。p肌动蛋白是肌动蛋白家族的一员，广泛表达于真核生物非肌细胞中，是构成细胞骨架的维持、细胞运动、细胞 分裂等。作为一种细胞质肌动蛋a, e肌动蛋g在所有组织屮相对持续稳定表达，因此e肌 动蛋白基因常用作定量研究的对照基因。由管家基闵的旮份决定，p肌动蛋內基因的启动子 为强启动了，对于提高转®因表达具冇显著的效果，其表达不受组织的限制。关键词：p肌动蛋白克隆分析一材料与方法1.1组织dna的提取1.1.1材料细胞裂解缓冲液蛋白酶k te缓冲液酚:氯仿:异戊位(25:24:1)1.

2、 1.2过程1. 取新鲜或冰冻动物组织块0. lg，尽量剪碎，置于玻璃匀浆器中， 加入iml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1. 5ml离心管中， 加入蛋白酶k20ml，混均，在65° c恒温水浴锅中水浴20min，间歇振 荡离心管数次，于台式离心机以12000rpm离心5min,取上淸液入另 一个离心管中。2. 加2倍体积异丙醇，倒转混均后，可以看到丝状物，用100ml吸头 挑出，晾干，用200mlte重新溶解。3. 加等量的酚：氯仿；异戊醇振荡混均离心12000rpm, 5分钟4. 取上层溶液至另一试管加入1/2体积的7. 5mol/l乙酸铵，加入2倍体积的无水乙醇，混均后

3、室温沉淀2分钟，离心12000rpm, 10分 钟。5. 小心倒掉上清液,将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液滴除掉。6. 用lml70%乙醇洗涤沉淀物离心12000rpm, 5分钟。7. 小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上将附于管壁上的残余液 滴除掉。8. 加200mlte重新溶解沉淀物，然后置于4° c或20° c保存备用。1.2 pcr1.2.1过程配制25毫升反应体系在pcr板屮依次加入模板dnalul下游引物，pcr预混液12.5 ul ddh2o 9.5ul设置pcr反应体系程序 94 °c 532个循环94°c 30s 55 &#

4、176;c 30$ 72°c is72 °c 10s上样，启动反应程序, 扩增产物的产物检测1. 3电泳1.3.1材料50xtae缓冲液lxtae缓冲液溴化乙啶欵存液6x上样缓冲液dna样品dnaladder掠 脂糖1.3. 2过程制备1%琼脂糖凝胶:称取1. 5g琼脂糖置于锥形瓶中，假如150mltae， 瓶!倒扣小烧杯100°c加热煮沸3次，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶。 胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃 板，取透明胶带将玻璃与内槽两端边缘封好，形成模子将冷却到65°c 左冇的琼脂糖凝胶混匀小心倒入内槽，形成均匀胶层。加样

5、：在点样板伤感混合dna样品和上样缓冲液。电泳：加样后的凝胶立即通电进行电泳，加压110v，样品由负极向 正极方向移动。观察照相：在紫外灯t观察，dna存在则显绿色荧光带，拍照保存。1.4连接1.4. 1过程与t载体连接（pud-18t）pud-18t取0. 5-l.ou，冋收纯化的dna2u （或3_4u）看具体浓度加水互补至5 u 1再加入5 u 1 solution i （冰上助融）共10 u 1在16qc放置30min之后4°c过液转化：大肠杆菌（dh5a ）1. 从-70°c冰箱屮去除感受态细胞，放入冰水屮融化，放置大约lomin2. 用冷却后无菌吸头将连接好的i

6、）na混合液加入到感受态细胞中（没 100p 1感受态细胞加连接产物5 pl）轻旋转，混匀内容物，在冰 上放置30min3. 再将离心管放到42°c的水浴锅中热激90s切勿摇动试管4. 迅速转移到冰浴屮，使细胞冷却l_2min5. 每管加400 u 1的lb液体培养基，转移到37°c摇床上，温浴45min 转速不超过125转，使细胞复苏（一般得4-5h菌液xl*能浑浊）摇 完后4000rpm离心2-3min，弃去上清200 ul，使菌液浓度增加， 用枪吹打后，再涂平板（此步可在4°c保存）6. 涂平板，尽量迅速至菌液被吸收，如吸收不完全正放30min之后倒放在37

7、qc培养箱过液1.5转化1.5. 1过程从-70°c冰箱屮取出感受态细胞，放入冰水屮融化，大概放置lomin; 用冷却的无菌吸头将连接好的dna混合液加入到感受态细胞中（没 100 pl感受态细胞加连接产物5 pl）轻轻旋转，混匀内容物，在冰 上放置30min；再将离心管放到42°c的水浴锅中热激90s，切勿摇动 离心管；迅速转移到冰浴中，使细胞冷却l_2min;每管加400ul的 lb液体培养基，转移到37°c摇床上125转，使细胞复苏，摇完后 4000rpm离心3min,弃去上清液200 u l,然后用枪吹打后涂平板， 37°c培养箱中过夜；用枪头挑

8、单菌落接于5ml液体lb培养基中，摇 12h后提取质粒。用ecor i和hindlll进行质粒双酶切或pcr鉴定 1.6质粒dna的提取1.6.1材料1. x-gal（5-溴-4-氯-3卩引啜-3-d半乳糖）x-gal溶于n, n'-二甲基 甲酰胺中配20mg/ml原液。-2（tc避光保存2. iptg （异丙基-p -d半乳糖苷）0. 2g/ml分装贮存于_20°c3. 氨t青霉素（ampiaillin） lg ampiaillin溶于5ml灭菌水中。配成母液保存于_20°c1.6.2方法平板准备：在40微升x-gal （中加入4微升iptg充分混合，在 无菌条件

9、下涂布于含amp （浓度50微升每毫升）的lb平板上将平 板至于37°c恒温箱屮2-3h,意识培养基充分吸收色素底物x-gal涂板：将转化菌在无菌条件下涂布于含抗生素和x-gal iptg的平 板上正面朝上放置30分钟，待菌液完全被吸收后倒置平板。37°c培养12-18h1.7验证pcr扩增实验实验材料：1. 仪器：吸头，pcr仪器，移液枪2. 材料pcr预混液12.5微升，水9.5微升，上游引物1微升，下游 引物1微升，组织dna1微升实验内容及步骤：1配制25微升反应体系，在pcr板中依次加入卜*列溶液中 模板rna 1微升上游1微升下游引物1微升，pcr预混液12.5

10、微 升，ddh2o0.95 微升。2. 设置pcr反应程序强变性94摄氏度5分钟变性94摄氏度30秒退火58摄氏度30秒延伸72摄氏度1分钟最后延伸72摄氏度8分钟共32个循环3. 上样启动反应程序4. 扩增产物的电泳检测（取5毫；t） 项目：电泳实验所用设备：水电泳槽，电泳仪，凝胶成像分析系统，微波炉，微量移液器，透明 胶带，点样板，锥形瓶，量筒，吸头。50xtae, tris溶液，edta溶液，去离子水，1xtae缓冲液琼脂糖溴化 乙叮贮存液，溴化乙啶，溴酚蓝，甘汕，其他，dna样品。实验内容及步骤：1. 琼脂糖凝胶电泳的制备：称取1. 5克琼脂糖置于锥形瓶中，加入150毫升1xtae瓶口

11、倒扣小 烧杯100摄氏度加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成百分之1琼脂糖凝胶液。2. 胶板制备：取电泳槽内有机玻璃内槽洗干净晾干，放入制胶玻璃板，取透明胶带 将玻璃板与槽两端边缘封好形成模子。将内槽置于水平位置，并固定 位置放好梳子，将冷却到65摄氏度左右的琼脂糖凝胶完全凝固垂直 轻拔梳子，取不胶带，将凝胶剂内槽放入电泳槽中，添加1xtae电泳 缓冲液至没过胶板为止。3. 加样：在点样版上混合dna样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数 应不小于lx，用1微升微量移液管枪分别将样品加入胶板的样品小 槽内，每加完一个样品应更换一个加样头，以防止污染，加样时五碰 坏样品周围的凝胶面。4. 电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60100伏特，样品由负极 向正极方向移动，电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离，范围降低，当 溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处吋，停止电泳。5. 观察照相：在紫外灯下观察，dna存在则显示出红色荧光条带采 用凝胶成像系统拍照保存。二结果分析实验成功提取出目的基因，进行pcr扩増，然后进行电泳，电泳表现出荧光带并 且两条荧光带都处在10(t200bp之间，证明pcr扩增成功。再进行蓝白斑验证时，由于没冇立即涂匀氨苄青霉素导致培养基屮心青霉素浓度 过高，没有生氏菌落。从没有加入x-gal