LCMS定性定量方法与技术

1、1会计学LCMS定性定量方法与技术定性定量方法与技术1. LC/MS的基本数据与信息的基本数据与信息2. LC/MS定性分析技术定性分析技术3. LC/MS定量分析技术定量分析技术本讲内容：TICBPCTICEIC m/z 311.0805SO+ONH2SNH3+OONH2NH3+NNOOCH3CH3SNH2+NNOOOONH2CH3CH3specific to sulfadimethoxinecommon to all sulfonamidesSO+ONH24 GHzResolution 121841x1000.511.522.533.544.555.566.577.588.599.5+ P

2、roduct Ion (0.820-0.966 min, 10 scans) (311.08060z=1 - *) sulfas_10ng_4GHz-016.d 156.0760412184156.0108712238156.112269868Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)155.78 155.8155.82 155.84 155.86 155.88 155.9155.92 155.94 155.96 155.98156156.02 156.04 156.06 156.08 156.1156.12 156.14 156.16 156.18 156.215

3、6.22 156.24 156.26 156.28156.3156.32 156.34NH3+NNOOCH3CH3m/z 156.0773m/z 156.0119平均分子量平均分子量（average molecular mass）由分子中各元素的（相对）平均原子量计算所得。由分子中各元素的（相对）平均原子量计算所得。a “Atomic Weights of the Elements 1987,” Pure Appl. Chem. 1988，60：841 括号内的数值为测不准水平，主要是同位素丰度的自然变化。例如，氢原子量为1.007940.00007 元素 原子量a H 1.00794（7）

4、C 12.011（1） N 14.00674（7） O 15.9994（3） F 18.998403（9） Na 22.989768（6） Si 28.0855（3） P 30.973762（4） S 32.066（6） Cl 35.452（9） K 39.0983（1） Br 79.904（1） I 126.90447（3） 同位素同位素质量质量a a天然丰度（天然丰度（% %）b b1 1H H1.0078250351.00782503599.98599.9852 2H H2.0141017792.0141017790.0150.0151212C C121298.998.91313C C1

5、3.0033548313.003354831.11.11414N N14.00307414.00307499.6399.631515N N15.0001089715.000108970.370.371616O O15.9949146315.9949146399.7699.761717O O16.999131216.99913120.040.041818O O17.999160317.99916030.20.21919F F18.9984032218.998403221001002323NaNa22.989676722.98967671001002828SiSi27.976927127.9769

6、27192.2392.232929SiSi28.976494928.97649494.674.673030SiSi29.973770129.97377013.13.13131P P30.97376230.9737621001003232S S31.972070731.972070795.0295.023333S S32.9714584332.971458430.750.753434S S33.9678666533.967866654.214.213636S S35.9670806235.967080620.020.023535ClCl34.9688527334.9688527375.7775.

7、773737ClCl36.9659026236.9659026224.2324.233939K K38.963707438.963707493.258193.25814040K K39.963999239.96399920.0120.0124141K K40.961825440.96182546.73026.73027979BrBr78.918336178.918336150.6950.698181BrBr80.91628980.91628949.3149.31127127I I126.904473126.904473100100单同位素分子量单同位素分子量（mono isotopic mol

8、ecular mass）由分子中各元由分子中各元素中丰度最高（素中丰度最高（最轻）的同位素最轻）的同位素的（相对）原子的（相对）原子量计算所得量计算所得单键裂解伴随电荷的迁移单键裂解伴随电荷的迁移 CH3-CH2-OH2+ CH3-CH2+ + H2O键的裂解伴随环化及电荷的迁移键的裂解伴随环化及电荷的迁移 环状离子断裂两个键，电荷保留环状离子断裂两个键，电荷保留两个键的断裂，伴随着重排两个键的断裂，伴随着重排 如烷链较长，通过六元环的如烷链较长，通过六元环的位氢重排为优势过程，这是发生在偶电子离子上的位氢重排为优势过程，这是发生在偶电子离子上的McLafferty重排重排磷酸二酯键的磷酸二酯

9、键的4种可能的裂解产生种可能的裂解产生8种离子，含种离子，含5-OH的离子称的离子称an 、bn 、cn和和dn而含而含3-OH的离子称的离子称wn 、xn 、yn和和zn。下标下标n指示其裂解位置。碱基的进指示其裂解位置。碱基的进一步丢失用括号表示，如一步丢失用括号表示，如a3-B3（A）表示键的开裂发生在表示键的开裂发生在3位的磷酸二酯基的位的磷酸二酯基的核糖碳原子和氧原子之间并在同一位置进一步丢失了腺苷碱基。核糖碳原子和氧原子之间并在同一位置进一步丢失了腺苷碱基。为了解释互补离子为了解释互补离子an-Bn和和wn的形成，提出了几种裂解途径，例如：的形成，提出了几种裂解途径，例如：上述裂解

10、途径中首先通过上述裂解途径中首先通过1，2消除丢失碱基。这一消除可能是由于分子间的碱催化产生消除丢失碱基。这一消除可能是由于分子间的碱催化产生的（的（3磷酸酯基的带负电的氧原子）。然后，由这一中间体通过磷酸二酯基的磷酸酯基的带负电的氧原子）。然后，由这一中间体通过磷酸二酯基的3C-O键键的开裂产生的开裂产生an-Bn和和wn碎片。碎片。电荷保留在非还原端的碎片称A、B、C，而电荷保留在还原端的碎片称X、Y、Z。 NNNNNOOBuspironeC21H31N5O2MW = 385150200250300350400450500m/z255075100Relative Abundance3864

11、08(M+H)+(M+Na)+NHNNNOONHNOO100150200250300350400m/z255075100Relative Abundance122386222150265180NNNNHNOO(M+H)+磺胺类药物的磺胺类药物的母离子扫描母离子扫描: Q3 固定在固定在 m/z 122NNNNNOOOH100200300400500m/zRelative Abundance402386910111213141516Time (min)255075100Relative Abundance11.6213.8413.1614.4012.1310.4515.45NNNNNOOQ3中性

12、丢失扫描中性丢失扫描: Q1/Q3 质量差为质量差为121 Da100200300400500m/zRelative Abundance402386910111213141516Time (min)255075100Relative Abundance13.9211.6913.2115.5010.58NNNNNOONNNNNOOOH-寻找代谢物-寻找代谢物Original TICProcessed TIC3D Plot No Background Data Reduced sum intensities of isotopes, adducts, clusters and multiply c

13、harges ions together.Finds Features in TOF/QTOF DataCoeluting Features预测Nefazodone的phase I和phase II代谢产物及其mass shift Mass shiftExpected resultsUnexpected resultsParent drug MS/MSMetabolite MS/MSMass-to-charge (m/z)Retention timeParent drugmetaboliteProcessed TICProcessed TICProcessed TICGroup A (meta

14、bolite)Processed TICProcessed TICProcessed TICGroup B (Control)Aligns Data RT, Mass, AbundanceAll Data RT/MassWhats Changed? Mass/RT 2 Fold ChangeWhats Unique! Metabolite ControlMass vs. Retention Time0510152025Retention Time (min)01002003004005006007008009001000Mass (Da)将将MP分析中得到的代谢物样品独有的分析中得到的代谢物样

15、品独有的features，带入自建的，带入自建的Metlin database，进，进行所搜，即可得到可能存在的代谢物。行所搜，即可得到可能存在的代谢物。 质谱定量数据质谱定量数据 四极质谱法四极质谱法 飞行时间质谱法飞行时间质谱法1 用用SIM, SRM等方法等方法 采用提取离子流采用提取离子流(EIC)2 随着选择监测的离子种类随着选择监测的离子种类 提取多种离子检测灵敏度提取多种离子检测灵敏度 的增加，检测灵敏度下降的增加，检测灵敏度下降 不受影响不受影响3 为提高专属性，需同时记为提高专属性，需同时记 提供待测成分的全谱、准提供待测成分的全谱、准 录录 “定性离子定性离子” 确质量、实

16、验式、不饱和确质量、实验式、不饱和 度、同位素丰度比等信息度、同位素丰度比等信息4 低分辨，对低分辨，对tR和和m/z相近的相近的 高分辨，可定量测定名义高分辨，可定量测定名义 离子难以定量离子难以定量 质量相同而准确质量不同质量相同而准确质量不同 的离子的离子 NNNNNOOBuspironeC21H31N5O2MW = 385150200250300350400450500m/z255075100Relative Abundance386408(M+H)+(M+Na)+NHNNNOONHNOO100150200250300350400m/z255075100Relative Abundan

17、ce122386222150265180NNNNHNOO(M+H)+磺胺类药物的磺胺类药物的 LC/ESI-MS/MS, SRM Mode 10 pg/mL Buspirone, Spiperone & Haloperidol in Bovine Plasma 100 fg on column Ballistic Gradient Method 1 mL/min (no split) Total acquisition time = 1.6 min0.60.70.80.91.01.11.21.31.41.51.6Time (min)200040006000800050001000015

18、000Intensity1000200030004000RT: 1.00RT: 1.061.22RT: 1.09Buspirone386 122Area = 7929Spiperone396 165Area = 10268Haloperidol376 165Area = 15744PlasmaContaminant -基于准确质量EIC的药物动力学研究10ng/ml notoginsenoside R1EIC m/z 967.531967.532 MS spectrum of notoginsenoside R1EIC m/z 967.0968.0-基于准确质量EIC的药物动力学研究01000

19、20003000400050006000700080009000020406080100120时间（小时）浓度（ng/ml）Mean-Rb1Mean-RdMean-R1Mean-Rg1Mean-ReRagu Ramanathan , International Journal of Mass Spectrometry xxx (2010) xxxxxx CSI allows the use of conventional HPLC or uHPLC columns and flow rates of 0.350.6 mL/min (before post column flow splitti

20、ng) and can be considered as a technique which can function as a nanospray or microspray. Also, in comparison to conventional nanospray ionization (NSI) techniques, setup and maintenance of CSI do not require:(1) X, Y, and Z positioning or cameras to guide the spray positioning, (2) difficult to con

21、trol splitters to deliver nano-flow ratios and difficult to maintain nanospray nozzles. Evaluations using equimolar mixture of buspirone and four monoxymetabolites present in human plasma show that LCCSI-MS is a highly sensitive technique that gives a near equimolar response for the compounds used i

22、n this example. Comparisons of LCESI-MS data with that obtained using LCCSI-MS show that reasonable quantification of metabolites may be achievable without using reference standards or administration of radiolabeled drugs. Ragu Ramanathan,J Am Soc Mass Spectrom 2007, 18, 18911899Thank you for your attention! 谢谢各位的关注！TICEIC m/z 311.0805SO+ONH24 GHzR