细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告

1、细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基 木培养基屮补充所缺乏的营养因子才能生长。1原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生 型相同关于培养基：基本培养基(minimal medium, mm):仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基， 丿t1 來表示。完全培养基(complete medium, cm):凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然 或

2、半组合培养基。用+ 來表示。补充培养基(supplemental medium, sm)：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的 纽全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。摘要：木实验选用紫外线为诱变剂，來诱发人肠杆菌突变，并川青霉素法淘汰野生型， 逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸 缺陷型。关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验r的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般貝有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩

3、、检出、鉴定缺 陷型。木实验选川紫外线为诱变剂，来诱发突变，并川青霉索法淘汰野生型，逐个测定法检出 缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液 管，培养皿，接种针四、实验材料()菌种 e. col i2(二)培养基、1 lb 培养液：酵母膏,05g；蛋白腺，lg； nacl, 0. 5g；水,100ml, ph7. 2121°c 灭菌 15min23 2xlb培养液：其它不变，水，50mlo基本培养基：葡萄糖0.5 g, (nii4)2s04 0. 1 g,柠檬酸钠 0. 1 g, mgs04

4、7h200. 02 g, k2hp04 0.4 g, kh2p04 0.6 g,重蒸水 100 ml, ph 7.2, 110°c灭菌 20 mine配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药甜需用分析纯，使用的器皿需 用蒸饰水或重蒸水冲洗23次。4无n基木液体培养基：k2hp04, 0. 7g； kh2p04,0. 3g;柠檬酸钠 3ii20, 0. 5g； mgsod 7ii20, o.olg;葡萄糖 2g；水 100ml, pii7. 0 110°c灭菌 20min5 2n基本培养基：k2iip04, 0. 7g； kh2p04,03g;柠檬酸钠 3ii20, 0

5、. 5g； mgs04 7ii20, o.olg; (nh4)2s04, 0.2g;葡萄糖 2g；水 100ml, ph7. 0 110°c灭菌 20min67完全培养基同lb培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。泯合氨棊酸和混合维 生素五、实验步骤(一)诱变处理1th day,接种：取一坏e. coli于5mllb液体三角瓶中,37°c培养过夜。2th day,诱变：早上添加5mllb液,继续培养5小时,取5ml菌液与离心管中,离心 （3500rpm） 10分钟（注意配平，相对两管相差不超过0. olg）,弃上清，加生理盐水 5ml,打匀沉淀，吸菌液3ml于75mm培养

6、皿内,将培养皿置于15w紫外灯下30cm处（处 理前紫外灯预热30min）,将培养皿连同盖一起置于15w紫外灯下灭菌lmin,然后打开皿 盖照射l-3min,照射后先盖上皿盖再关灯。吸3ml 2倍lb液加入处理过的菌液平ii1l内， 混匀，用黑布（纸）包好，置37°c避光培养12h以上。（二）营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）3th day,延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心loniin,奔上清。离心洗涤 两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最3后加生理盐水 制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5nd无n培养基屮，371培养12h。（消耗体内的n

7、 素，使停止生长，避免缺陷型被以后加入的青霉素杀死）4th day,初筛：按1:1比例加 入2n基木培养液5ml,加5 jj u/ml青幾索钠盐溶液looul,使青霉索在溶液屮的最终浓 度约为500u/ml,再放入37°c培养。（野生型利用氮大量生长，细胞壁不能完整合成而死 亡。缺陷型因不长避免被杀死）。5th day,从培养12、14、16、24小时（根据实际情 况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.51菌液到基本及完全培养基两个培养皿中， 涂布，37°c培养。（三）营养缺陷型检岀7th day,检出营养缺陷型。上述平板培养36-48h后，进行菌落计数。选取完全培养

8、基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，川灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌 落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37°c培养。9th day,选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37°c培养24h,仍不k的是营养缺陷型。（四）营养缺陷型鉴疋在同一 平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况为生长谱法。单一生长因了：鉴定氨基酸或维生索的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。将 21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。如果以15种维生索进行测定，则 把5种维生素归为一纽，共5个纽合。纽别1 2 3 4

9、 5 6氨基酸组介组赖姐酸缄姐酸苏姐酸内抵酸鸟如酸脈氨酸精氨酸精氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸异亮氨酸蛋氨酸胱氨酸亮氨酸色氨酸脯氨酸甘氨酸甘氨酸丝氨酸界亮氨酸组氨酸犬冬氨酸丝氨酸谷氨酰胺谷氨酰胺苯丙氨酸 酪氨酸苯丙氨酸谷氨酸酪氨酸色氨酸组氨酸谷奴酸脯氨酸天冬姐酸4维生素组介组组别1 2 3 4 5维&素a维牛素c叶酸对氨基苯甲酸41物素维生索b1维生索b1维生索b2维生索b6维生索b12维生素b2维生素d2维生索d2维生索e烟酰胺维生素b6维生素e胆碱胆碱泛酸钙维空素b12朋酰胺泛酸钙肌醇肌醇10th day,生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml lb液试管屮，37°c培

10、 养 14 16ho11th day,培养16h的菌液离心。3500rpm, lomin,弃上清,加生理盐水,打匀沉淀, 再次离心。加5m生理盐水制成菌悬液。1r-k 1ml于培养皿屮，加入融化后冷却到40 5（tc的基本培养基，混匀，平放，共二皿。（平板表面分别沾上沾有混合氨基酸（或酪索 水解液）的滤纸片，30°c培养24h,经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为氨基酸的 营养缺陷型菌株）。将iiil底分成分格用接种坏依次放入少许混合氨基酸等，37°c培养 24h,观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。生长谱鉴定点样图示1叶酸b组维生索喘噪腺嚟吟2右图中1、2、3、4、5均为氨基酸组合图1六、实验结果与分析1、营养缺陷型检出5点植对照时每平iiil点30株菌，最后基木培养基只有100#菌没有长出，即筛选出一株营养缺陷型菌株。2、营养缺陷型鉴定 通过如图1生长谱鉴定，得到如图2结果：生长谱鉴定结果图分析：可以观察到2. 4号滤纸片周围有生长圈。通过杳表鉴定为脯氨酸缺陷型。七、实验结论与讨论结论：本实验选用紫外线为诱变剂，來诱发人肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#人肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。讨论：1、注意事项：紫外线对皮肤和眼睛有很大伤害，实验中应避免人体暴