细胞培养生产紫杉醇的系统生物技术学习教案

1、会计学1第一页，共58页。生物制药与现代中生物制药与现代中药药(zhngyo)工程工程 第1页/共57页第二页，共58页。第2页/共57页第三页，共58页。概述(i sh)1958,美国NCI开始筛选新型抗肿瘤药物研究计划(jhu); 美国化学家Wani和Wall于1971年从太平洋红豆杉树皮中提取到一种抗肿瘤物质紫杉醇。紫杉醇的发现紫杉醇的发现(fxin)第3页/共57页第四页，共58页。与微管蛋白 N 端第31位、217 231位氨基酸结合，抑制微管解聚，抑制有丝分裂，阻滞(z zh)细胞周期于G2/M期,使癌细胞死亡。紫杉醇作用紫杉醇作用(zuyng)机机理理:概述(i sh)(1979

2、(1979年年) )第4页/共57页第五页，共58页。概述(i sh)19921992年年FDAFDA批准批准(p zhn)(p zhn)紫杉醇紫杉醇20062006年年FDAFDA批准批准(p zhn)(p zhn)多烯紫杉醇多烯紫杉醇晚期(wnq)乳腺癌, 晚期(wnq)非小细胞肺癌晚期(wnq)卵巢癌, 胰腺癌、头颈癌胃癌,前列腺癌第5页/共57页第六页，共58页。OCH3COOOHOHOOC6H5COOC6H5OOHC6H5CONHCH3COO321101372概述(i sh)紫杉醇与多烯紫杉醇紫杉醇与多烯紫杉醇H(CH3)3CO第6页/共57页第七页，共58页。1)1)天然红豆杉植物

3、天然红豆杉植物(zhw)(zhw)提取法提取法概述(i sh)第7页/共57页第八页，共58页。2) 化学化学(huxu)全合全合成成(2) Nicoloau路线路线(lxin)-会聚式会聚式 A环和环和C环环 八元八元B环，得到环，得到ABC三环化合物。三环化合物。(3) Danishefsky路线路线(lxin)-会聚式会聚式 D环环与与A和和C、D环片段连接，合成八元环片段连接，合成八元B环。环。(1) Holton路线路线(lxin)-线性途径线性途径(2) AABABC。HOCH3COOOHOHOOC6H5COOROBCAD第8页/共57页第九页，共58页。(2R,3S)-3-N-苯

4、甲酰基苯甲酰基- 苯基苯基(bn j)异丝氨酸异丝氨酸避免了合成紫杉醇复杂避免了合成紫杉醇复杂(fz)的母环部的母环部分分321OHC6H5OOHC6H5CONH母核：红豆杉针叶中提取母核：红豆杉针叶中提取巴卡亭巴卡亭 III（R=Ac）或或10-去乙酰基巴卡亭去乙酰基巴卡亭 III（10-DAB，R=H）HOCH3COOOHOHOOC6H5COORO110137第9页/共57页第十页，共58页。 红豆杉细胞培养红豆杉细胞培养 2004年年6月月28日，日，Bristol-Myers Squibb 获总统绿色获总统绿色(l s)化学挑战奖。化学挑战奖。4)生物工程生物工程(shn w n ch

5、n)方法方法概述(i sh)第10页/共57页第十一页，共58页。第11页/共57页第十二页，共58页。形态变化形态变化:细胞分化与紫杉醇生细胞分化与紫杉醇生产细胞应答机理产细胞应答机理(j l): 活性氧迸活性氧迸发刺激紫杉醇合成发刺激紫杉醇合成,同时引起细同时引起细胞凋亡胞凋亡微环境微环境(hunjng)剪切力场剪切力场现象现象(xinxing)实验实验关键问题第12页/共57页第十三页，共58页。系统生物系统生物(shngw)技术技术DNADatabasesCompare, cluster, integrateNew Theory: structure and functionNew A

6、pplication: industrial process improvement数据数据(shj)有待积有待积累累理论有待建立理论有待建立最终必将突破最终必将突破第13页/共57页第十四页，共58页。基因组基因组+ +转录转录(zhun l)(zhun l)组回答为什么组回答为什么? WHY? WHY蛋白质组回答如何蛋白质组回答如何(rh)(rh)进行进行? HOW? HOW代谢组回答是什么代谢组回答是什么? WHAT? WHAT回答工业过程的三个基本问题回答工业过程的三个基本问题第14页/共57页第十五页，共58页。ProteomicsMetabolomicsLipidomics第15页

7、/共57页第十六页，共58页。微环境(hunjng):固定化: 15mmh: 15mm固定化提高固定化提高(t go)了紫杉醇的产量了紫杉醇的产量第16页/共57页第十七页，共58页。固定化不同固定化不同(b tn)区域的细胞活性与产量区域的细胞活性与产量的关系的关系紫杉醇合成活力(hul)：由外层到核心增加细胞(xbo)活力：由外层到核心降低第17页/共57页第十八页，共58页。固定化细胞出现固定化细胞出现(chxin)分化：分化：AGPs 表达表达Susp.Immob.Cheng JS, Lei C, Wu JC, Yuan YJ*. Journal of Biotechnology, 2

8、008, 133(1): 96-102. 第18页/共57页第十九页，共58页。Susp.Immob.ERK-like 磷酸化固定化细胞固定化细胞(xbo)的信号转导的信号转导与调控与调控Cheng JS, Yin DM, Yuan YJ*. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 39(6): 1250-1257第19页/共57页第二十页，共58页。固定化细胞对固定化细胞对MAP like-Kinases 磷酸化响应及调控磷酸化响应及调控(dio kn)作用作用Cheng JS, Yuan YJ*. Biotechnology and Applied B

9、iochemistry, 2006, 44: 109-117 第20页/共57页第二十一页，共58页。Cheng JS, Yuan YJ. Proteomics 2006, 6, 2199-2007 2-DE2-DE和和MSMS，细胞生长、生产与固定化微环境作用，细胞生长、生产与固定化微环境作用(zuyng)(zuyng)的关系蛋白质组。的关系蛋白质组。发现氮、硫和糖代谢相关的蛋白质与细胞分裂和次代谢产物之间的关系发现氮、硫和糖代谢相关的蛋白质与细胞分裂和次代谢产物之间的关系为细胞培养方式选择提供依据为细胞培养方式选择提供依据蛋白组分析方法揭示蛋白组分析方法揭示(jish)固定化细胞时空异质性

10、固定化细胞时空异质性第21页/共57页第二十二页，共58页。Oxidative response of cells induced by shear stressHistochemical detection of H2O2 in cells by DAB staining Cell death was evaluated by Evans Blue staining 第22页/共57页第二十三页，共58页。Changes of four identified proteins in media based on 2-D 第23页/共57页第二十四页，共58页。Functional categ

11、ories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS 第24页/共57页第二十五页，共58页。Functional categories of identified proteins by 2-D LC-MS/MS J-S Cheng, Y-J Yuan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009, 58:8492 第25页/共57页第二十六页，共58页。Metabolite profiling of Taxus cells in response to shear stress by GC-TOF-

12、MS 第26页/共57页第二十七页，共58页。Total ion chromatograms of Taxus cells for GC-MS analysis.P-P Han and Y-J Yuan. Biotechnology Progress. doi: 10.1002/btpr.209第27页/共57页第二十八页，共58页。(B) Loading plot generated from PCA analysis. (D) VIP plot from PLS analysis. Multivariate analysis by PCA and PLS.Score plots from

13、PCA (A) and PLS (C).第28页/共57页第二十九页，共58页。Variations of intracellular metabolites under shear stress. A total of 65 intracellular metabolites第29页/共57页第三十页，共58页。Mmetabolite abundance onto the metabolic network.Shear stress inhibiting TCA cycle and N metabolism. Co-induction of glycolysis and accumulati

14、on of compatible solutes第30页/共57页第三十一页，共58页。(a)(a)得分得分(d fn)(d fn)图图(b)(b)载荷载荷(zi h)(zi h)图图PCAPCA分析正常分析正常(zhngchng)(zhngchng)细胞和细胞和不同诱导子胁迫的诱导不同诱导子胁迫的诱导细胞细胞MeJA和和Ce4+诱导东北红豆杉细胞磷脂酶的差异激活及诱导东北红豆杉细胞磷脂酶的差异激活及下游脂质信号分子的信号转导模型下游脂质信号分子的信号转导模型0.00.40.81.21.612 h24 h050100150200250 Ce4+ (JA) Ce4+ + EYTA (JA) Ly

15、soPC (nmol mg-1 DW) JA (ng g-1 FW) Ce4+ (LysoPC) Ce4+ + EYTA (LysoPC) 010203040048121620 Taxol ( g g-1 DW) Taxol Ce4+Control ApoptosisApoptotic ratio (%)ControlCe4+Ce4+EYTACe4+EYTAYang S, Lu SH, Yuan YJ. BBA-Mol. Cell Biol. L.1781 (2008) 123134 IF:3.539诱导子作用下红豆杉细胞膜磷脂代谢信号转导诱导子作用下红豆杉细胞膜磷脂代谢信号转导第31页/共5

16、7页第三十二页，共58页。Phospholipidomics of Taxus cells responsing to shear stress第32页/共57页第三十三页，共58页。Negative-ion LC/ESI/MS base peak chromatogram of phospholipids from Taxus cells 40 h after shear stress treatment. PG, phosphatidylglycerol; PE, phosphatidylethanolamine; PC, phosphatidylcholine; LysoPC, lyso

17、phosphatidylcholine. PA, phosphatidic acid; PI, phosphatidylinositol; PS, phosphatidylserine;第33页/共57页第三十四页，共58页。Phospholipid contents in shear stress-induced Taxus cells. 第34页/共57页第三十五页，共58页。Score plots from PCA (A) and PLS (C). (B) Loading plot from PCA. (D) VIP plot from PLS. Multivariate analysi

18、s by PCA and PLS.第35页/共57页第三十六页，共58页。LysoPC Changes of biomarker phospholipidsPAP-P Han and Y-J Yuan. FASEB J. 2009 23: 623-630. 第36页/共57页第三十七页，共58页。Activation of phospholipase D Activation of phospholipase CDefining the enzymatic source of PA.第37页/共57页第三十八页，共58页。Analysis of lipidomics of Taxus cell

19、s in response to shear stress第38页/共57页第三十九页，共58页。Phospholipid contents in shear stress-induced T. cells. Decrease total phospholipids,Structural phospholipids such as PG, PE, and PC第39页/共57页第四十页，共58页。Sterols profiles of T. cells第40页/共57页第四十一页，共58页。Fatty acids profiles in T. cells第41页/共57页第四十二页，共58页。

20、Variations of fatty acids under shear stress. Increase very-long-chain saturated FAIncrease monounsaturated FADecrease short chain saturated FA第42页/共57页第四十三页，共58页。Schematic changes of sterol abundance onto the plant sterol biosynthetic pathway. 第43页/共57页第四十四页，共58页。The ratios of campesterol: sitoster

21、ol, stigmasterol: sitosterol, and stigmasterol: campesterol in shear stress-induced T. cells. vIncrease stigmasterol at the expense of sitosterol and campesterol第44页/共57页第四十五页，共58页。The ratios between sterols and phospholipids in shear stress-induced T. cells. P-P Han, J Zhou, Y-J Yuan. Biotechnology

22、 and Applied Biochemistry doi:10.1042/BA20090102第45页/共57页第四十六页，共58页。合成(hchng)生物学第46页/共57页第四十七页，共58页。第47页/共57页第四十八页，共58页。第48页/共57页第四十九页，共58页。第49页/共57页第五十页，共58页。第50页/共57页第五十一页，共58页。Nature Biotechnology 21, 796 - 802 (2003) by Jay D Keasling第51页/共57页第五十二页，共58页。FPPFPP积累：染色体水平修饰，积累：染色体水平修饰，tHMGRtHMGR（双拷贝）、（双拷贝）、ERG20 ERG20 、upc2-1upc2-1过表达，阻断过表达，阻断ERG9ERG9。ADSADS酵母表达，酵母表达，FPPFPP转化转化(zhunhu)(zhunhu)二烯。二烯。青蒿青蒿CYP71AV1