培养基的制备2

1、第二讲第二讲 植物组织培养基的制备植物组织培养基的制备培养基的重要性培养基的重要性:1)植物材料生长的营养来源；植物材料生长的营养来源；2)调节植物材料生长与分化的主要途径。调节植物材料生长与分化的主要途径。第一节第一节 培养基的组成培养基的组成培养基种类比较多培养基种类比较多共同之处共同之处：含含有植物生长发育所必须的营养物质和生有植物生长发育所必须的营养物质和生物活性物质物活性物质( (激素）激素）不同之处：不同之处：配制培养基的化学试剂、培养基成分的浓配制培养基的化学试剂、培养基成分的浓度与比例不同度与比例不同成成 分分培养基名称培养基名称MSSHB5WPMVW大量元素大量元素 (mg/

2、L)KNO3190025002500525NH4NO31650400NH4H2PO4300Ca(NO3)24H2O556(NH4)2 SO4134500K2SO4990MgSO47H2O370400250370250CaCl22H2O44020015096KH2PO4170170250Na H2PO4150Ca3(PO4)2200微量元素微量元素 （mg/L）MSSHB5WPMVWMnSO4H2O101022.5MnSO44H2O22.37.5KI0.831.00.75H3BO36.25.03.06.2ZnSO47H2O8.61.02.08.6CuSO45H2O0.0250.20.0250.2

3、5Na2MO42H2O0.250.10.250.25CoCl26H2O0.0250.10.025FeSO47H2O27.815.027.827.8Na2EDTA37.320.037.337.3Fe2(C4H4O6)328.0酒石酸铁酒石酸铁有机营养（维生素和氨基酸有机营养（维生素和氨基酸, mg/L）MSSHB5WPVWNicotinic acid (烟酸烟酸)0.55.01.00.5Pyridoxin-HCl (Vt-B6)0.50.51.00.5Thiamine-HCl (Vt-B1)0.15.010.01.0myo-inositol (肌醇肌醇)1001000100100Glycine(

4、甘氨酸甘氨酸)2.02.0碳源碳源(sugar, g/L)Sucrose蔗糖蔗糖30 30 20 20 20 二、无机营养二、无机营养 不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度不同培养基的无机盐（特别是大量元素）的浓度差异很大。差异很大。 16种必需元素：种必需元素：大量元素：大量元素：C, H, O, N, P, K, Ca, Mg, S微量元素：微量元素：Fe, Cl, Cu, Mo, B, Zn, Mn一、一、 水水 蒸馏水、去离子水，双蒸水蒸馏水、去离子水，双蒸水三、三、 有机营养有机营养 常用：常用：肌醇、烟酸、维生素肌醇、烟酸、维生素B6、维生素、维生素B1和和甘氨酸等。甘氨酸等

5、。 其它的维生素：其它的维生素：维生素维生素M（叶酸）、维生素（叶酸）、维生素B2（核黄素）、泛酸钙等。（核黄素）、泛酸钙等。 其它氨基酸：其它氨基酸：谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺等酸、天冬酰胺等难培养的材料，可增加有机成分的种类。难培养的材料，可增加有机成分的种类。 四、碳源四、碳源 最常用的糖是蔗糖最常用的糖是蔗糖(sucrose)，但也有用葡但也有用葡萄糖萄糖(glucose)、果糖、果糖(fructose)或其它的糖，或其它的糖，有时几种糖混用。有时几种糖混用。 糖是营养物质，但不是越多越好。培养糖是营养物质，但不是越多越好。培养基中糖的用量大多在基中糖

6、的用量大多在10- -60g/L，一般为，一般为20- -30 g/L。 五、五、 植物生长物质植物生长物质=植物激素植物激素植物生长物质是植物激素和植物生长调植物生长物质是植物激素和植物生长调节剂的总称。节剂的总称。植物激素：植物激素：植物合成的、微量就有显著效应的植物合成的、微量就有显著效应的物质。物质。植物生长调节剂：植物生长调节剂：人工合成的、具有植物激素人工合成的、具有植物激素相似作用的物质。相似作用的物质。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类。根据功能不同，植物生长物质共分为五大类。1.1.生长素生长素(Auxins) NCH2COOHindole acetic acid (IA

7、A) 吲哚乙酸吲哚乙酸 (IAA) 吲哚丁酸吲哚丁酸 (IBA) 120元元/1g187元元/5gSigma公司公司-Naphthalaene acetic acid (NAA) CH2COOH萘乙酸萘乙酸(NAA)314元元/25g2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)ClClOCH2COOH2,4-二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸(2,4-D)除草剂除草剂240元元/100g生长素的在组织培养中的主要作用：生长素的在组织培养中的主要作用： (1) 促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；织； 2,4-DNAAIAA, IBA (2) 控

8、制器官的分化，诱导根的形成、控制器官的分化，诱导根的形成、抑制芽的诱导。抑制芽的诱导。 诱导根的作用：诱导根的作用：IBANAAIAAZeatin 玉米素玉米素 (ZT) （遇高温不稳定）（遇高温不稳定）CH3HNCH2-CH=CNNNNCH3H常用常用2. 细胞分裂素细胞分裂素 ( (Cytokinins) ) 574元元/5mg13256元元/250mg番茄、杨树番茄、杨树NNNNHNCH2-CH=CCH2OHCH3H异戊烯基腺嘌呤异戊烯基腺嘌呤: 2-isopentenyl adenine, 2iP; 遇高温不稳定遇高温不稳定1226元元/1g杜鹃花杜鹃花6-benzylaminopur

9、ine6-苄基氨基嘌呤（苄基氨基嘌呤（6-BA, BA, BAP） NNNNHNCH2OH最常用最常用298元元/1g Kinetin 激动素激动素 （KT） NNNNHCH2HN常用常用688元元/1gThidiazuron (TDZ；噻苯隆 ): 棉花脱叶剂；后发现具有强烈的细胞分裂素的作用，比BA的效果高几十-几百倍。常用常用730元元/25mg噻苯隆噻苯隆 细胞分裂素在植物组织培养中的细胞分裂素在植物组织培养中的主要作用：主要作用：1. 促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组促进细胞分裂、增殖，形成愈伤组织；织；2.2.控制器官的分化，诱导芽的形成和控制器官的分化，诱导芽的形成和增殖、抑制根的

10、诱导。增殖、抑制根的诱导。 生长素和细胞分裂素的发现和应用对于植物组织生长素和细胞分裂素的发现和应用对于植物组织培养技术的建立起了决定性的作用。培养技术的建立起了决定性的作用。1957年：年：Folke Karl Skoog和和 Carlos Miller发现培养基中生发现培养基中生长素和激动素浓度比值决定烟草愈伤组织根或芽的形成。长素和激动素浓度比值决定烟草愈伤组织根或芽的形成。Folke Karl Skoog (July 15, 1908 February 15, 2001) In 1962, Skoog and Toshio Murashige 发表了最著名的植物组织培养基，Murash

11、ige and Skoog medium, MS培养基培养基 。Murashige T and Skoog, F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 18: 100-127)生长素浓度生长素浓度细细胞胞分分裂裂素素浓浓度度生根生根生芽生芽愈伤愈伤组织组织细胞分裂素细胞分裂素/生长素的比值：生长素的比值：高：形成芽；高：形成芽；低：形成根；低：形成根；相当：愈伤组织增殖，但不分化相当：愈伤组织增殖，但不分化=植物器官分化的激素调控模式

12、植物器官分化的激素调控模式具有普遍性：在很多植物上得到证明具有普遍性：在很多植物上得到证明是进行植物组织培养技术研究最重要的是进行植物组织培养技术研究最重要的指导思想指导思想。3 3、赤霉素、赤霉素 （Gibberellins） 赤霉素种类很多，有七、八十种，赤霉素种类很多，有七、八十种，其中以赤霉酸其中以赤霉酸3（Gibberellic acid,GA3）用得最普遍。用得最普遍。OCCCOOHCH3CH2OHHOO675元元/1gGA3赤霉素的生理作用赤霉素的生理作用赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，赤霉素最显著的作用是促进细胞的伸长，也有打破种子休眠的作用。也有打破种子休眠的作用。在植物

13、组在植物组织培养中使用赤霉素主要用于促进芽织培养中使用赤霉素主要用于促进芽或茎的伸长。或茎的伸长。赤霉素对热不稳定，故不能用高温法消赤霉素对热不稳定，故不能用高温法消毒。毒。4 4、乙烯、乙烯 CH2=CH2 乙烯促进果实成熟，加速植物衰老。乙烯促进果实成熟，加速植物衰老。植物组织培养极少使用乙烯（乙烯植物组织培养极少使用乙烯（乙烯利），相反，而是尽量控制乙烯的利），相反，而是尽量控制乙烯的产生。产生。 5 5、脱落酸（、脱落酸（Abscisic acid） ABA OCH3OHCOOHCH3CH3CH3400元元/100mg热不稳定热不稳定 促进植物的衰老，促进植物的衰老，植物组织培养很植物

14、组织培养很少用。少用。在胚状体（在胚状体（embryoid）的诱导和培养）的诱导和培养中常常使用脱落酸，促进胚状体的中常常使用脱落酸，促进胚状体的成熟。成熟。 七、有机附加物七、有机附加物 （Organic additives） 水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白水解酪蛋白、水解乳蛋白、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物：胨、酵母提取物：用量为用量为0.1-10g/L，一般为，一般为0.5-3 g/L。 椰子汁：椰子汁：100-200ml/L100-200ml/L。 这些物质的成分复杂、不明确，统称为这些物质的成分复杂、不明确，统称为有机附加物。当材料生长不好时，加入这些有机附加物。当材料生长不

15、好时，加入这些物质往往可以会明显改善材料的生长状况。物质往往可以会明显改善材料的生长状况。 六、凝固剂六、凝固剂琼脂（琼脂（agar）是最常用的凝固剂，用量为）是最常用的凝固剂，用量为6-12g/L。另外还有另外还有phytagel, Gelrite, 4g/L。 八、其它物质八、其它物质 防止与减缓植物材料褐化的物质：防止与减缓植物材料褐化的物质：1）抗氧化剂：）抗氧化剂：抗坏血酸（抗坏血酸（Vc）、）、L-半光氨半光氨酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等。2）吸附剂：）吸附剂：活性炭（活性炭（无选择性）无选择性）、聚乙烯聚乙烯吡咯烷酮（吡咯烷酮（PVP；酚类物质吸附剂酚类物质

16、吸附剂）。 蝴蝶兰叶片的褐化蝴蝶兰叶片的褐化山药褐化山药褐化活性炭对茎段培养的影响活性炭对茎段培养的影响 第二节第二节 培养基的配制培养基的配制 垂吊海棠垂吊海棠 芽诱导培养基配方：芽诱导培养基配方：MS+蔗糖蔗糖30.0 g/L+琼脂琼脂8g/L+BA 2.0 mg/L+NAA0.1 mg/LMS培养基培养基大量元素大量元素mg/L微量元素微量元素mg/LKNO31900MnSO44H2O22.3NH4NO31650KI0.83MgSO47H2O370H3BO36.2CaCl22H2O440ZnSO47H2O8.6KH2PO4170CuSO45H2O0.025烟酸烟酸0.5Na2MO42H2

17、O0.25Vt-B60.5CoCl26H2O0.025Vt-B10.1FeSO47H2O27.8肌醇肌醇100Na2EDTA37.3甘氨酸甘氨酸2.0 为了便于培养基的配制，实际操作过为了便于培养基的配制，实际操作过程中可以先将常用的成分配成一定浓程中可以先将常用的成分配成一定浓度的母液度的母液（stock solution），），然后在然后在配各种试验培养基时取一定量的母液配各种试验培养基时取一定量的母液稀释。稀释。 可以配成母液的是无机盐、有机成可以配成母液的是无机盐、有机成分和植物激素等。分和植物激素等。 1 1、无机盐母液的配制、无机盐母液的配制（以以MS培养基培养基为例）为例） 1

18、1）大量元素母液的配制）大量元素母液的配制： 大量元素浓度比较高，故大量元素浓度比较高，故母液浓度母液浓度( (倍数倍数) )不能过大，否则溶解不完全，容易析出不能过大，否则溶解不完全，容易析出( (特别特别是冬天是冬天) )，使用很不方便，一般为，使用很不方便，一般为20、5050或或100倍。倍。 另一个要考虑的问题是高浓度时有些另一个要考虑的问题是高浓度时有些离离子之间发生会发生相互作用子之间发生会发生相互作用，形成沉淀，如，形成沉淀，如SO42-、PO43-和和Ca2+之间。因此，在之间。因此，在母液母液浓度浓度较高时，较高时，Ca盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。盐要与硫酸盐、磷酸盐分开。

19、因此，因此，母液浓度高时母液浓度高时MgSO4和和CaCl2要分开。要分开。如把如把KNO3和和CaCl22H2O配在一起（母液配在一起（母液 I），）， NH4NO3 、MgSO47H2O和和KH2PO4配在一起（母配在一起（母液液 II） ，这样，即使母液浓度达到，这样，即使母液浓度达到100倍也不会出倍也不会出现沉淀。现沉淀。 MS大量元素大量元素mg/LKNO31900NH4NO31650MgSO47H2O 370CaCl22H2O440KH2PO4170以以MS培养基为例培养基为例:当母当母液浓度为液浓度为20倍时，这倍时，这5种种盐配在一起，不会出现盐配在一起，不会出现沉淀；但当母

20、液浓度达沉淀；但当母液浓度达到到50倍时就出现沉淀。倍时就出现沉淀。2 2）微量元素母液的配制）微量元素母液的配制： 除铁盐外除铁盐外，其它微量元素可以全部配在，其它微量元素可以全部配在一起，浓度常为一起，浓度常为100200倍。倍。 Fe2+容易变成容易变成Fe3+而形成沉淀，不利于植而形成沉淀，不利于植物材料的吸收，所以把物材料的吸收，所以把FeSO4同同Na2EDTA配在一起，形成络合铁配在一起，形成络合铁（稳定，植物利用（稳定，植物利用度高）度高）。其母液浓度为。其母液浓度为100- -200倍。配法倍。配法是先分别将是先分别将FeSO4和和Na2EDTA溶解，然后溶解，然后等体积混合

21、，边混合边搅拌，混合液为黄等体积混合，边混合边搅拌，混合液为黄色。色。 微量元素母液和铁盐要放在冰箱中保存。微量元素母液和铁盐要放在冰箱中保存。 2. 有机成分母液的配制有机成分母液的配制 一种培养基的有机成分一种培养基的有机成分( (氨基酸和维氨基酸和维生素生素) ) 可以配在一起可以配在一起,100-200,100-200倍。倍。有机成分母液应放在冰箱中保存，有机成分母液应放在冰箱中保存，否则容易生霉、变质。否则容易生霉、变质。 3. 植物激素母液的配制植物激素母液的配制 每种植物激素要单独配一种母液，浓每种植物激素要单独配一种母液，浓度为度为0.5- -1.0 mg/mL。激素不易溶于水

22、，。激素不易溶于水，但易溶但易溶有机溶剂（乙醇、二甲基亚砜）有机溶剂（乙醇、二甲基亚砜）和和稀酸稀碱。稀酸稀碱。70-90%70-90%乙醇：乙醇：溶液无菌，加入培养基后溶液无菌，加入培养基后pHpH不不变。变。稀酸稀碱：稀酸稀碱：需要过滤灭菌；加入培养基后需要过滤灭菌；加入培养基后pHpH会变。会变。 激素母液也应在低温下保存。激素母液也应在低温下保存。 第三节、培养基的制备第三节、培养基的制备 1. 根据植物材料、培养目的设计好试验培根据植物材料、培养目的设计好试验培养基的配方养基的配方（基本培养基，糖、植物激素、（基本培养基，糖、植物激素、琼脂和其它成分的浓度），琼脂和其它成分的浓度），

23、并且要准确无并且要准确无误的写在实验记录本上误的写在实验记录本上2. 根据培养基的体积和母液浓度，求出各根据培养基的体积和母液浓度，求出各种成分的用量种成分的用量3. 根据计算出来的结果，配成各种培养基根据计算出来的结果，配成各种培养基诱导垂吊海棠叶片形成不定芽诱导垂吊海棠叶片形成不定芽 培养基：培养基：MS+蔗糖蔗糖30.0 g/L+琼脂琼脂8.0 g/L+BA 2.0 mg/L+NAA0.1 mg/L，pH值值5.8，体积，体积1000 ml。其操作步骤如下：其操作步骤如下：1 1、计算出各种成分的用量，填写、计算出各种成分的用量，填写培培养基记录表养基记录表2 2、配制过程、配制过程 （

24、1） 称好称好30.0g蔗糖和蔗糖和8.0g琼脂，放入搪瓷量杯琼脂，放入搪瓷量杯或其它金属容器中，加或其它金属容器中，加600ml左右（总体积的左右（总体积的2/3）蒸馏水，加热、煮沸）蒸馏水，加热、煮沸5min，至琼脂完全熔，至琼脂完全熔化；化；（2） 按量加入各种成分，然后用蒸馏水定容至按量加入各种成分，然后用蒸馏水定容至1000ml；(在记录表上打钩，防止漏加、多加在记录表上打钩，防止漏加、多加)（3） 用用KOH或或NaOH和和HCl调调pH值至值至5.8。非常。非常重要，重要，pH值不仅影响琼脂培养基的凝固效果，值不仅影响琼脂培养基的凝固效果，而且也影响培养基中营养成分的有效性和植物

25、而且也影响培养基中营养成分的有效性和植物材料的生长状况材料的生长状况（不同植物材料有不同的最佳（不同植物材料有不同的最佳pH环境，水稻、杜鹃花、兰花等喜欢偏酸性）。环境，水稻、杜鹃花、兰花等喜欢偏酸性）。（4） 分装到培养容器中，容器盛培养基量分装到培养容器中，容器盛培养基量为容器体积的为容器体积的1/5-1/3，但不要超过，但不要超过2/3，容，容器封口。器封口。3 3、培养基的消毒、培养基的消毒 培养基做好以后，要及时消毒，培养基做好以后，要及时消毒，否则容易滋生细菌和真菌。这不仅否则容易滋生细菌和真菌。这不仅会改变培养基的成分，而且菌物还会改变培养基的成分，而且菌物还会产生有毒的物质。培

26、养基的消毒会产生有毒的物质。培养基的消毒方法有如下几种：方法有如下几种： 1） 高温灭菌法高温灭菌法：简单、易行；一次可以灭菌：简单、易行；一次可以灭菌大量的培养基，最常用。所用的温度是大量的培养基，最常用。所用的温度是121，压力是，压力是1.11.2大气压。大气压。高温消毒时应注意的问题：高温消毒时应注意的问题：1. 一定要先排气一定要先排气10 min，否则不能消毒不，否则不能消毒不彻底；彻底；2.2. 高温消毒后，培养基的高温消毒后，培养基的pH值会下降值会下降0.20.5个个pH单位单位；3.3. 高温消毒过程中，培养基中有些物质会高温消毒过程中，培养基中有些物质会被破坏或发生沉淀。

27、如蔗糖会水解成葡被破坏或发生沉淀。如蔗糖会水解成葡萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；萄糖和果糖，葡萄糖变成葡萄糖酸等；有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉有些物质甚至几乎完全被破坏，如赤霉素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时素、玉米素等。物质破坏程度与消毒时间和压力有关。间和压力有关。 培养基体积与消毒时间的关系培养基体积与消毒时间的关系 培养基体积（培养基体积（ml） 消毒时间（消毒时间（min） 20- -50 20（121） 50- -500 25（121） 500- -5000 35（121） 空试管、空瓶，培养皿、空试管、空瓶，培养皿、滤纸等用具滤纸等用具 30（130） 2) 过滤灭菌

28、法过滤灭菌法过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培过滤消毒不会破坏培养基的成分和改变培养基的养基的pH值值，所以在原生质体和单细胞，所以在原生质体和单细胞培养时要用过滤消毒法对培养基进行灭培养时要用过滤消毒法对培养基进行灭菌。菌。热不稳定的物质，如热不稳定的物质，如ZT、2ip2ip、GA3、核、核黄素等，也要用过滤消毒法灭菌黄素等，也要用过滤消毒法灭菌 无菌微孔滤膜：孔径无菌微孔滤膜：孔径0.2-0.45 m，比微生物及其孢子直径小，比微生物及其孢子直径小过滤灭菌的操作：过滤灭菌的操作： 先将微孔滤膜（孔径先将微孔滤膜（孔径0.2-0.45 m，用，用前最好在蒸馏水中浸泡数小时）装入滤前最好在蒸馏水中浸泡数小时）装入滤头中，用纸或布将其包好，再高温灭菌；头中，用纸或布将其包好，再高温灭菌；在超净工作台上取出滤头，用注射器吸在超净工作台上取出滤头，用注射器吸取培养基或溶液，将注射器接在滤头入取培养基或溶液，将注射器接在滤头入口端，推动注射