生长因子及凋亡相关蛋白在糖尿病骨骼肌病变中的作用

1、天津医科大学硕士学位论文生长因子及凋亡相关蛋白在糖尿病骨骼肌病变中的作用姓名：马春明申请学位级别：硕士专业：内分泌与代谢病学指导教师：张宏;焦振山20050501天津医科大学f i | j f ：母f 究生学位论文缩写b F G FV E G FP V DS T Zm R N AP C N AI i G FA G E sE C MH S P G sP D G FP C DB c l 2A I英文缩略语英文名称中文名称b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r碱性成纤维细胞生长因子v a s c u l a re n d o t h e

2、l i a lg r o w t hf a c t o r血管内皮生长因子p e r i p h e r a lv a s c u l a rd i f f e a s e周围血管病变s t r e p t o z o c i n链脲佐菌素m e s s e n g e rR N A信使核糖核酸p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n增殖细胞核抗原h e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o t肝细胞生长因子a d v a n c e dg l y c a t i o ne n d p

3、 r o d u c t s终末糖基化产物e x t r a c e ll u l a rm a t r iX细胞外基质h e p a r a as u l p h a t ep r o t e o g l y c a n s硫酸乙酰肝素蛋白多糖p l a t e l e td e r i v e dg r o w t hf a c t o r衄小板衍生生长因子p r o g r a m m e dc e l1d e a t h程序化细胞死亡Bc e l l1 y m p h o m a l e u k l e m i a 一2B 细胞淋巴瘤白血病一2a p o p t o s i si n

4、d e x凋亡指数第1 页天津医科大学颤一L 秽 究生学位论文中文摘要目的：糖尿病的慢性并发症可累及全身各组织器官。骨骼肌是全身利用葡萄糖最重要的组织之一，也是高m 糖损害的主要靶位，骨骼肌病变又使外周胰岛素抵抗加重。近年来生长因子及凋亡相关蛋白在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复中的作用受到了越来越广泛的重视。碱性成纤维细胞生长园子、血管内皮生长因子及凋亡相关蛋白b c 卜2 和b a x 在糖尿病及肌肉病变中有着重要作用。本研究通过糖尿病大鼠及后肢缺皿模型观察了糖尿病骨骼肌生长因子和凋亡相关蛋白表达的变化，进一步了解糖尿病肌病的发病机制。方法：选用w i s t a r 大鼠，

5、随机分成四组：正常对照组、单纯后肢缺血组、糖尿病组和糖尿病后肢缺血组，每组6 只。以四氧嘧啶5 0 m g k g 体重尾静脉注射制造糖尿病大鼠模型，血糖均 1 6 6 5 m m o l L 。2 周后，单纯缺血组和糖尿病缺血组则分别将正常大鼠和糖尿病模型大鼠通过结扎右股动脉制造缺血模型。在糖尿病造模成功后观察1 0 周，处死大鼠，取右下肢腓肠肌，常规石蜡包埋切片。通过H E 染色观察肌组织形态改变，应用免疫组织化学方法观察腓肠肌中b F G F 、V E G F 、b c l - 2 及b a x 蛋白表达情况。结果：1 血糖正常对照组、单纯后肢缺血组、糖尿病组及糖尿病后肢缺血组血糖( m

6、 m o l L ) 分别为：4 9 0 1 0 2 8 8 、5 0 7 7 0 5 7 2 、2 4 2 1 3 2 3 6 7 、2 1 8 2 9 3 4 1 9 。糖尿病组及糖尿病缺血组血糖明显高于正常对照组和单纯缺血组( j p 均 o ，0 1 ) 。2 组织学观察正常对照组骨骼肌表现为正常的组织结构。单纯缺血组可见骨骼肌细胞胞浆浓缩，核固缩，肌纤维部分区域断裂。糖尿病组骨骼肌表现为普遍性萎缩，肌纤维变性坏死，核固缩，横纹模糊消失，间质脂肪组织增生。3 b F G F 和V E G F 蛋白表达的变化F 常骨骼肌可见b F G F 表达，阳性细胞呈棕黄色。正常对照组、单纯缺血组、

7、糖尿病组及糖尿病缺盘组阳性率( ) 分别为：6 9 4 3 5 4 8 3 4 、5 3 6 5 9 5 3 2 2 、3 5 5 1 0 3 3 7 6 、第2 页天津医科丈学硕f j 研究生学位论文2 5 4 2 4 5 0 6 9 。单纯缺血组和糖尿病组b F G F 表达减弱，与对照组相比有统计学意义( P 0 0 1 ) 。糖尿病缺血组与单纯缺血组和糖尿病组相比下降更为明显( P o O I ) aJ E 常对照组和糖尿病组腓肠肌均未见V E G F 表达，单纯缺血组和糖尿病缺血组可见V E G F 表达，阳性率( ) 分别为5 4 0 3 9 4 2 0 8 和2 0 6 7 5

8、L0 4 6 ，糖尿病缺血组V E G F 表达明显低于单纯缺血组r ( P = O 0 1 ) 。4 b c l 2 及b a x 蛋白表达变化正常对照组、单纯缺血组、糖尿病组和糖尿病缺血组b c l 一2 阳性率( )分别为：1 8 7 5 6 3 3 4 t 、1 8 2 1 9 2 7 7 I 、1 3 3 0 t 2 8 3 4 、1 2 3 2 0 2 8 3 0 ：b a x 阳性率( ) 分别为：2 0 5 6 0 7 0 3 、7 8 1 l 1 1 9 8 、1 2 9 9 4 2 1 7 5 、2 1 11 9 4 0 2 4 。糖尿病组大鼠骨骼肌b e l 一2 表达下

9、降，与丁F 常对照组比较具有统计学意义( 尸 O 0 1 ) 。正常对照组与单纯缺血组，糖尿病组与糖尿病缺血组相比则无显著的统计学意义。正常骨骼肌b a x 表达较少，糖尿病组和缺血组b a x 表达增加，与正常对照组比较具有统计学意义( 尸 0 0 1 ) ，且糖尿病缺血组b a x 表达增加更明显。结论：1 四氧嘧啶注射大鼠出现多饮、多食、多尿症状，体重下降，血糖明显升高。缺血组在结扎股动脉后出现大鼠趾端颜色苍白，皮温降低。病理切片证实高血糖和缺血对于骨骼肌的损伤。2 糖尿病组和单纯缺血组b F G F 水平均低于正常对照组，糖尿病合并缺血组b F G F 下降更为明显。难常骨骼肌未见V

10、E G F 表达，缺血可诱导，V E G F 表达，但糖尿病缺血组低于单纯缺血组。高血糖和缺血引起肌肉中生长因子变化是糖尿病骨骼肌萎缩的重要原因之一。3 糖尿病组与非糖尿病组相比b c l 一2 表达下降，但缺血组与非缺血组问b c l 一2 水平无差异。正常骨骼肌中b a x 表达较少，缺血和高血糖引起b a x 表达上调，糖尿病合并缺血组b a x 升高更为明显。肌肉中b c 一2 与b a x 比值下降可能通过促进凋亡加重骨骼肌病变。第3 页天津医科大学硕士研究生学位论立关键词：糖尿病肌病；大鼠；骨骼肌；生长因子；b c l 一2 b a x第4 页天津医科大学硕， 琊f 究生学位论文A

11、 b s t r a c tO b j e c t i v e ：T h ed i a b e t i cc o m p l i c a t i o n sc o u l di n v o l v ea l li m p o r t a n to r g a n s S k e l e t a lm u s c l ew a st h em a i nt a r g e tt i s s u eo fd i a b e t i cd a m a g e s T h ed i a b e t i cm y o p a t h ya g g r a v a t e di n s u l i nr

12、e s i s t a n c e I nr e c e n ty e a r s ，t h er o l eo fg r o w t hf a c t o r sa n da p o p t o s i sr e l a t e dp r o t e i n si na n g i o g e n e s i s ，d e v e l o p m e n ta n dr e p a i ro fs k e l e t a lm u s c l ew a sr e c o g n i z e d ，V E G F 、b F G F 、b c l - 2a n db a xt o o kp l

13、a yi m p o r t a n tr o l e si nd i a b e t i cc o m p l i c a t i o n s I nt h i ss t u d y ，t h ea n i m a lm o d e lo fi n j u r i e ds k e l e t a lm u s c l e so fd i a b e t e sc a u s e db yh y p e r g l y c e m i aa n di s c h e m i aw a sm a d et os t u d yt h er e l a t i o n s h i po fd i

14、 a b e t i cm y o p a t h yw i t h a p o p t o s i sr e l a t e dp r o t e i n sa n de n d o g e n e s i sg r o w t hf a c t o r s ，a n dt oe l u c i d a t et h ep a t h o g e n e s i so f d i a b e t i cm y o p a t h yf u r t h e r M e t h o d s ：2 4w i s t a rr a t sw e r ea v e r a g e l yd i v i

15、 d e di n t of o u rg r o u p s ：n o r m a lc o n t r o lg r o u p ，d i a b e t i cg r o u p ，n o n - d i a b e t i ci s c h e m i ag r o u pa n dd i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p D i a b e t e sw a sp r o d u c e di ne x p e r i m e n t a lg r o u pb yi n j e c t i o no f5 0m ga l l o x a nk

16、g B Wv i at h et a i lv e i n B l o o ds a m p l e sw e r et a k e nf r o mc a n t h u sv e i nf o rg l u c o s et e s ta f t e rt h r e ed a y so fi n j e c t i o n T h eg l u c o s el e v e l so fa l ld i a b e t i cr a t sw e r em o r et h a n16 6 5 m m o l L W ep r o d u c e di s c h e m i ar a

17、tm o d e lo ft h er i g h tl o w e rl i m bb yt h ef e m o r a la r t e r yl i g a t i o na f t e ri n j e c t i o n A f t e r10w e e k se x p e r i m e n t a lt e r m ，t h eg a s t r o c n e m i u ss a m p l e sw e r eo b t a i n e da n de m b e d d e di np a r a f f i n ，5 9 ms e c t i o nw a ss t

18、 a i n e db yH Ea n di m m u n o h i s t o c h e m i s t r y W eo b s e r v e dt h eg e n e r a ls t r u c t u r eo ft h em u s c u l a rt i s s u eb yH Es e c t i o n s T h ee x p r e s s i o n so f b F G F 、V E G F 、b c l 一2a n db a xi ng a s t r o c n e m i u sw e r es t u d i e db yi m m u n o h

19、 i s t o c h e m i s t r y R e s u l t s ：1 I nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，n o n d i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ，d i a b e t i cg r o u pa n dd i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ，t h ef a s t i n gg l u c o s el e v e l sw e r e4 9 0 1 士0 2 8 8 、5 0 7 7 4 - 0 5 7 2 ，2 4 2 1 3 4 -

20、 2 3 6 7a n d2 1 8 2 9 士3 4 1 9m m o l L r e s p e c t i v e l y T h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ng r o u p si nt h el e v e lo fg l u c o s e ( P 1 6 6 5 m r n o l L ) ，a n dn oh y p e r g l y c e m i aw a so b s e r v e di nt h ec o n t r o lm i c e 第5 贞天津医科大学

21、碗：研究生学位论文2 H i s t o l o g i c a lo b s e r v a t i o nW i t hH Es t a i n i n g ，t h es k e l e t a lm u s c l es e c t i o n si nc o n t r o lg r o u ps h o w e dn o r m a ls t r u c t u r e T h eg a s t r o c n e m i u sh a dk a r y o p y k n o s i s ，c y t o p l a s mc o n c e n t r a t i o na n

22、 dr u p t u r ea f t e ri s c h e m i a M o r p h o m e t r i cc h a n g e so fs k e l e t a lm u s c l ei ne x p e r i m e n t a ld i a b e t i cr a t sw e r ec h a r a c t e Ji z e dp r i m a r i l yb yw i d e s p r e a dm y a t r o p h y ，m u s c l ef i b e rd e n a t u r a l i z a t i o na n dn

23、e c r o s i s ，k a r y o p y k n o s i s ，t r a n s v e r s es t r i a t i o n so ft i l ef i b e r sd i s a p p e a r e da n di n t e r s t i t i a lf a t t yt i s s u eh y p e r p l a s i a 3 T h ee x p r e s s i o n so f b F G Fa n dV E G FT h ee x p r e s s i o no fb F G Fw a so b s e r v e d 讯n

24、 o r m a ls k e l e t a lm u s c l e ，p o s i t i v ec e l lp r e s e n t e dy e l l o wc o l o ra n dt h ep o s i t i v ep e r c e n t a g ew a s6 9 4 3 5 士4 8 3 4 T h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e ng r o u p si nt h ee x p r e s s i o no fb F G F T h ep o s i t

25、i v ep e r c e n t a g e si ni s c h e m i ag r o u pa n dd i a b e t i cg r o u pw e r e5 3 6 5 9 士5 3 2 2 、3 5 5 1 0 士3 3 7 6 C o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，t h ee x p r e s s i o no fb F G Fi ni s c h e m i ag r o u pa n dd i a b e t i cg r o u pd e c r e a s e d I nd i a b e t i c

26、i s c h e m i ag r o u p t h ep o s i t i v ep e r c e n t a g e2 5 4 2 4 士50 6 9 w a st h el o w e s ti na l lg r o u p s ( P O 0 1 ) T h e r ew a sn oe x p r e s s i o no fV E G Fi nt h eg a s t r o c n e m i u so ft h ec o n t r o la n dd i a b e t i cg r o u p T h ep o s i t i v ep e r c e n t a

27、 g e si ni s c h e m i ag r o u pa n dd i a b e t i ci s c h e m i ag r o u pw e r e5 4 0 3 9 士4 2 0 8 a n d2 0 6 7 5 + 1 0 4 6 T h ee x p r e s s i o no fV E G Fi nd i a b e t i ci s c h e m i ag r o u pw a sl o w e rt h a nt h a ti nt h en o n - d i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ( P= O 0 1 )

28、 4 T h ee x p r e s s i o no fb c l - 2a n db a xI nn o r m a lc o n t r o lg r o u p ，n o n d i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ，d i a b e t i cg r o u pa n dd i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ，t h ep o s i t i v ep e r c e n t a g e so fb c l 一2w e r e18 7 5 6 + 3 3 4 1 ，1 8 2 1 9 士2 7 7

29、1 1 3 3 0 1 + 2 8 3 4a n d1 2 3 2 0 士2 8 3 0 ；t h ep o s i t i v e p e r c e n t a g e so f b a xw e r e2 0 5 6 士0 7 0 3 ，7 8 1 1 士1 1 9 8 ，1 2 9 9 4 + 2 1 7 5a n d2 1 1 1 9 + 4 0 2 4 T h ee x p r e s s i o no fb c l - 2d e c r e a s e di ns k e l e t a lm u s c l eo fd i a h e t i cr a t s T h er e

30、 s M t se x s i t e ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nd i a b e t i ca n dn o n d i a b e t e i cg r o u p ( P O 0 5 ) T h e e v e o fb a xi nn o r m a ls k e l e t a lm u s c l ew a sv e r yl o w T h ee x p r e s s i o no fb a xi n c r e a s e di ni s c h e m i ag r o u pa n d

31、d i a b e t i cg r o u p ，e s p e c i a l l yi nt h ed i a b e t i ci s c h e m i ag r o u p ( P 1 6 6 5 m m o l J L 的大鼠为糖尿病模型动物1 。造模成功后，将实验组随机分为糖尿病组和糖尿病缺血组，每组各6 只；对照组随机分为正常对照组和单纯缺血组，各6 只。( 二) 肢体动脉缺血动物模型的建立：在糖尿病造模成功后2 周，将单纯缺血组和糖尿病缺血组大鼠以1 0 水合氯醛腹腔注射麻醉( 3 0 0 m g k g ) 。仰卧位，右下肢腹股沟切口，分离筋膜、股动脉鞘，充分暴露股动脉，

32、向远端游离股动脉切断分支，穿线近心端结扎股动脉2 “。实验期间动物室内温度2 2 2 ，相对湿度5 0 5 ，每日明暗时间交替各1 2 小时。每日无限制饮食，自由饮水，每周测体重一次，连续喂养l O 周。( 三) 标本的制备：饲养过程中血糖测定采取内眦静脉取血离心分离血清，葡萄糖氧化酶法测定血糖。W i s t a r 大鼠饲养1 0 周后，禁食但不禁水1 2 小时后称重。股动脉放血处死大鼠，迅速取右下肢腓肠肌，4 福尔马林固定，常规石蜡包埋后连续切片，切片厚度5 岫。( 四) 观测指标的测定方法血糖采用葡萄糖氧化酶法测定，参照说明书操作骨骼肌组织H E 染色观察组织病理形态变化骨骼肌b F

33、G F 、V E G F 、b e l 一2 及b a x 表达通过免疫组化法测定，参照说明书操作( 五) 实验步骤笫1 2 页天津医科人学烦卜研究生学位论文1 H E 染色( 1 ) 石蜡切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化至蒸馏水洗；( 2 ) 苏木素染色1 0 m in ，自来水冲洗；( 3 ) 赫酸乙醇分化3 0 S ( 提插数下) ：( 4 ) 浓氨水返蓝；( 5 ) 置伊红液中l m i n L( 6 ) 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片：2 免疫组化染色：( 1 ) 石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，3 甲醇一H 2 0 2 封闭内源性过氧化物酶，自来水冲洗5 m i n

34、，蒸馏水洗2 次；( 2 ) 切片入0 O l m o l Lp H 9 0 柠檬酸微波缓冲液中，于微波炉内，处理1 0 m i n ，温度维持在9 5 。C 左右，以修复抗原；( 3 ) 待微波液自然冷却至室温后，蒸馏水沈5 次，0 O l m o l Lp H7 2P B S 平衡5 m i n ，擦干切片周围液体，3 正常小牛血清室温孵育2 0 m i n ：( 4 ) 滤纸吸去多余血清，滴加一抗V E G F ( 稀释度1 ：1 0 0 ) 、b F G F ( 稀释度i ：2 0 0 ) 、b c l - 2 ( 稀释度1 ：2 0 0 ) 和b a x ( 稀释度l ：2 0 0

35、) ，阴性对照滴加P B s ，湿盒内室温放置2 0 m i n 后于冰箱中( 4 C ) 孵育过夜；( 5 ) 恢复室温后，P B S 振荡洗涤5 m in ，共2 次，根据一抗种属来源滴加生物素标记的羊抗兔或羊抗小鼠血清即二抗工作液，湿盒内于室温孵育1 h ；( 6 ) P B S 振洗5 m i n ，共2 次，后用D A B 显色，显微镜下监视显色反应，时间约为 O m i n 。自来水充分冲洗中止反应，苏木索复染细胞核，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察结果。3 结果判定：光镜下观察H E 染色切片病理形态变化。免疫组化切片中细胞质内见染成棕黄色颗粒的骨骼肌细胞，认

36、定为表达阳性细胞。每一切片在高倍镜下随机选取5 个视野，计数每一视野阳性细胞的百分率，取其均值表示该因子表达强度。第1 3 页灭津医科人学硕士研究生学位论文三统计学处理各种统计学处理均使用S P S S l l 5 统计软件。结果用均数标准差表示。两组数据比较采用独立样本T 检验统计处理，多组数据比较用A N O V A 方差分析进行统计处理，方差分析若有统计学意义再两两比较。检验水准a = 0 0 5 ，以P O 0 5 为差异具有统计学意义。第1 4 页天津医科大学坝士研究生学位论文实验结果1 动物模型的建立对照组饮水少、尿量少、毛色光滑、柔顺，体重随周龄增大而逐渐增长，血糖正常。糖尿病造

37、模后三日大鼠出现明显的多饮、多食、多尿症状，体重明显下降。缺血组在结扎股动脉后一日出现大鼠趾端颜色苍白，皮温降低。实验结束时，对照组、单纯缺血组、糖尿病组及糖尿病缺血组血糖分别为：4 9 0 I 0 2 8 8 、5 0 7 7 0 5 7 2 、2 4 2 1 3 2 3 6 7 、2 1 8 2 9 3 4 1 9 ( m m o l L ) ，经方差齐性检验，方差齐。多组问比较有统汁学意义( F = 1 4 8 1 9 ，P 0 0 0 1 ) 。糖尿病组及糖尿病缺血组血糖明显高于对照组和单纯缺血组( 尸 0 0 1 ) ，对照组和缺血组间( P = 0 9 7 8 ) 及糖尿病组和糖尿

38、病缺血组间( P = 0 6 6 2 ) 比较无统计学意义。2 组织学观察对照组骨骼肌表现为正常的组织学结构，肌膜完整、清晰，肌纤维上明暗条纹规则整齐，未见到肌纤维变性、坏死。( 附图1 ) 缺血组可见胞浆浓缩、红染，核固缩，横纹略模糊，肌纤维略呈波浪状，部分区域断裂。( 附图2 )糖尿病组骨骼肌表现为普遍性萎缩，肌纤维萎缩变细，纤维变性，水肿，部分区域坏死，纤维断裂，肌丝走行紊乱，核固缩，横纹模糊消失，问质脂肪组织略增生。( 附图3 、4 )3 b F G F 及V E G F 蛋白表达情况( 表1 ，图1 )正常骨骼肌可见b F G F 表达，阳性细胞呈棕黄色。对照组、单纯缺血组、糖尿病组

39、及糖尿病缺血组阳性率( ) 分别为：6 9 4 3 5 4 8 3 4 、5 3 6 5 9 5 3 2 2 、3 5 5 1 0 3 3 7 6 、2 5 4 2 4 5 0 6 9 ，多组间比较有统计学意义f F = 1 0 2 8 1 ，P O o o 。单纯缺血组和糖尿病组b F G F 表达减弱，与对照组相比差异具有统计学意义( P O 0 1 ) 。糖尿病缺血组与其他组相比下降更为明显( P o 0 1 ) 。( 附图5 8 )对照组和糖尿病组腓肠肌均未见V E G F 表达，单纯缺血组和糖尿病缺血组可见V E G F 表达，阳性率分别为5 4 0 3 9 _ 4 2 0 8 和2

40、 0 6 7 5 1 0 4 6 ，糖第1 5 页天津医科大学硕一I - ：r , ) f 究生学位论文尿病缺m 组V E G F 表达低于单纯缺血组( t = 1 8 8 4 ，P = 0 ，0 1 ) 。( 附图9 1 2 )表1 各组大鼠骨骼肌b F G F 及V E G F 表达阳性率( ) ( i s )组别nb F G FV E G F注：a 示与对照组相比P 0 0 1C - 示与糖尿病组相比P 0 0 1誉V_ | ； r隶b 示与单纯缺血组相比P 0 0 1d 示与单纯缺血组相比P = 0 O l图l 各组大鼠骨骼肌b F G F 及V E G F 表达阳性率( )4 b c

41、 l 2 及b a x 蛋白表达变化( 表2 ，图2 )免疫组织化学结果b c l 2 免疫阳性反应呈棕黄色，定位于胞浆内，细胞核经苏木素复染后呈蓝色。对照组和糖尿病组可见b c l 一2 表达，糖尿病大鼠骨骼肌b c l 2 表达下降，有统计学意义( P 0 0 1 ) 。( 附图1 3 、1 4 ) 缺血组与非缺血组相比均无统计学意义。正常骨骼肌b a x 表达较少，而糖尿病和单纯缺血组b a x 表达增加，有显著差异( P O 0 1 ) ，糖尿病缺血组增加最为明显( P ( o 0 1 ) 。第1 6 页天津医科大学删研究生学位论文对照组61 8 7 5 6 3 3 4 l2 0 5

42、6 4 - 0 7 0 3单纯缺血组6糖尿病组6糖尿病缺血组61 8 2 1 9 2 7 7 11 3 3 0 1 2 8 3 4 “1 2 3 2 0 + _ 2 8 3 0 8 67 8 1 14 - 1 1 9 8 81 2 9 9 4 4 - 2 1 7 5 82 1 1 1 9 4 - _ 4 0 2 4 8 “。F 值7 5 3 56 8 8 0 5P 值O 0 0 1O ，0 0 0注：a 示与对照组相比P O 0 1b 示与缺血组相比P O 0 1c 示与糖尿病组相比P 1 6 6 5 r e t o o l L ) ，为造模成功。葡萄糖是细胞生长的重要调节因子，而长期高血糖对

43、机体内环境有着普遍的毒性，引起一系列病理形态改变。F a h i m 等用链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病成模后4 2 同，发现实验小鼠的趾长伸肌呈不同程度的肌纤维变性和坏死，肌第2 7 页天i 聿医科大学颂一L 驯究生学位论文纤维均明显萎缩，肌纤维中脂肪过量沉积“。本实验以大鼠为模型，研究糖尿病骨骼肌病变，通过对骨骼肌的H E 染色的观察发现，光镜下骨髂肌的病理形态学改变主要表现为普遍性萎缩，舰纤维萎缩变细，纤维变性，水肿，韶分区域坏死，纤维断裂，肌丝走行紊乱，核固缩，横纹模糊消失，间质脂肪组织略增生。肌肉形态的损伤导致骨骼肌功能下降，表现为糖尿病患者肌肉萎缩、收缩力下降。糖尿病下肢动脉血管病变(

44、1 0 w e r e x t r e m i t ya r t e r i a ld i s e a s e ，L E A D )又称周围血管病变( p e r i p h e r a lv a s c u l a rd i s e a s e ，P V D ) 是导致下肢截肢的主要原因，8 0 0 的病人在诊断糖尿病时即已存在L E A D ，并随年龄、病程的增加而增多，至2 0 年后其发病率可达4 5 0 0 。周困血管病变导致下肢缺血，进一步加重骨骼肌损伤。本研究通过结扎右股动脉制造下肢缺血模型，观察缺血对骨骼肌的损伤。缺血组在结扎股动脉后出现大鼠趾端颜色苍白，皮温降低。随病程延长症状

45、有所恢复，可能与缺血肢体侧支循环形成有关。病理切片观察到骨骼肌出现胞浆浓缩、红染，核固缩，横纹略模糊，肌纤维略呈波浪状，部分区域断裂等缺血性病理改变。通过组织形态观察我们证实了高血糖和缺血对于骨骼肌的损伤。生长因子及凋亡相关蛋白在骨骼肌生长发育、肌肉内血管生成及肌肉损伤后修复中起重要作用。但对糖尿病及周围血管病变引起下肢缺血对骨髂肌生长因子及凋亡相关蛋白影响了解较少。我们通过糖尿病大鼠后肢缺血模型观察了糖尿病骨骼肌生长因子和凋亡相关蛋白表达的变化，进一步探讨糖尿病肌病的发病机制。二、糖尿病骨骼肌碱性成纤维细胞生长因子表达的改变及意义成纤维细胞生长因子是一种具有广泛生物活性的肽类物质，1 9 7

46、 4 年由G o s p o d a r o w i z 从牛脑垂体和脑组织中被提纯，因它能促进3 T 3 成纤维细胞分裂增殖，被命名为成纤维细胞生长因子。在成纤维细胞生长因子家族的成员有多种不同类型，其中以碱性成纤维细胞生长因子( b a s i cf i b r o h l a s tg r o w t h笫2 9 砸天津医科大学坝十i i J 究生学位论义f a c t o r ，b F G F ) 的研究较为充分1 。b F G F 是分子量1 7 2 0 K D 的多肽，比酸性成纤维细胞因子活性高1 0 0 倍，是由1 5 4 个氨基酸组成的单链蛋白质，以自分泌、旁分泌和向细胞内分泌

47、的途径发挥生物学活性，具有广泛的生物效应。在血浆溶酶原的活化、细胞的迁移、胚胎的发育以及细胞分化等方面都发挥了重要的作用，是强烈的促有丝分裂原。研究发现b F G F 存在于多种组织，局限在胞浆和细胞外基质，在细胞或组织损伤时释放，对靓卫星细胞、成肌细胞、血管内皮细胞、骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞等中胚层和神经外胚层来源的细胞有明显的促增殖作用。5 f 【i c h a l 等由成年犬股二头肌活检获得分离的肌卫星细胞。与基础介质培养细胞相比，添N b F G F 导致卫星细胞大量增生。但不同来源和类型的b F G F 之间存在差异“。b F G F 对于各年龄组卫星细胞增生皆有作用。国外学者

48、通过肌纤维模型比较3 周龄、8 到1 0 周龄、9 到1 1 月龄鼠卫星细胞的增生活力。在添加b F G F 培养中的细胞，三个时间段卫星细胞皆有增殖细胞核抗原( p r 0 1i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ，P C N A ) 和生肌调节因子M y o D 表达，2 4 4 时后持续存在P C N A + M y o D + 阳性状态。b F G F 使有增生能力的卫星细胞增加2 倍“。D o u m i t 等通过猪骨骼肌卫星细胞培养，检测b F G F 、E G F 、I G F 和P D G F的促有丝分裂效应。b

49、 F G F 和I G F I 显著增加增生。b F G F 、P D G F B B 、E G F 和I G F I培养的卫星细胞比普通培养基卫星细胞D N A 合成增加5 倍。去除b F G F 后使增生减少2 0 他0 1 。体外实验发现b F G F 诱导C 2 C 1 2 成肌细胞增生和迁移，增加血管生成，导致肌肉生成瞳“。同时b F 6 F 在成肌细胞迁移和融合所需的蛋白分解过程中起重要作用。体外实验发现b F G F 显著增加白明胶酶基质金属蛋白酶一9 和细胞膜纤溶系统活性。诱导成肌细胞尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂( u r o k i n a s e t y p ep l a

50、s m i n o g e na c t i v a t o r ，u P A ) m R N A 表达泓2 ：”。肌组织的生长和再生是高度有组织的多步骤的过程。肌肉损伤时，受损部位的的肌卫星细胞活化分裂增殖。分裂所得后代被称为成肌细胞，其渐融第2 9 页天= i 聿医科大学硕 研究生学位沦立合成多核的肌管，逐渐发育成为骨骼肌细胞“1 1 。b F G F 是这些步骤的关键调节因子，在骨骼肌损伤后修复中起重要作用，b F G F 缺失导致肌组织的严重萎缩。C l a r k e 等研究发现机械负荷增加导致舰膜损伤。舰膜的损伤导致F G F 释放是机械负荷刺激骨骼肌生长的重要内分泌机制。F G

51、F 的中和抗体可抑制慢性机械负荷诱导的肌细胞生长“。M e n e t r e y 通过给鼠腓肠肌撕裂伤处注射生长因子，通过损伤后一月组织收缩成分测定评价肌肉愈合，发现b F G F 增加肌肉再生。在一个月时，b F G F 改善愈合和显著增加肌肉的快缩和强直拉力“”。而在鼠趾长伸肌损伤时( 失神经和血行阻断) 注射抗b F G F 中和抗体，发现再生毛细血管及巨噬细胞数量减少，巨噬细胞吞噬坏死肌纤维的能力下降。此种情况下，再生肌纤维的数量减少，真径变细，说日f J b F G F 与肌纤维再生有关“。受损骨骼肌修复失常引起的肌肉萎缩是未控制糖尿病的一个显著特征。b F G F 在肌肉损伤修复

52、中起重要作用，国外学者研究糖尿病大鼠骨骼肌b F G F m R N A 表达，发现高糖环境抑制肌肉b F G F m R N A 表达“。由于生长因子功能的执行者是蛋白质，而从m R N A 至t J 蛋白质还需要一个翻译过程，因此，要了解h F G F 在糖尿病骨骼肌病变中的作用，还需了解病变过程中b F G F 蛋白在翻译水平表达的变化，才能作进一步客观评价，本研究应用免疫组化方法发现，b F B F蛋白本身在正常骨髂肌纤维表达为阳性。从定位上来讲，b F G F 蛋白主要位于胞浆和胞外基质。糖尿病大鼠骨骼肌b F G F 表达3 5 5 1 0 3 3 7 6 明显低于对照组6 9 ，

53、4 3 5 4 8 3 4 ，更进一步证明高糖环境抑制骨骼肌内源性b F G F 表达。同时体外实验发现高糖环境中培养内皮细胞，胞浆中糖基化的b F G F 明显增多，b F G F 促有丝分裂活性却丧失了7 0 ，提示b F G F 促有丝分裂活性的丧失源自终末糖基化产物( a d v a n c e dg l y c a t i o ne n d p r o d u c t s ，A G E s ) 对b F G F 翻译后的修饰作用。在体外进一步用果糖，6 一磷酸一葡萄糖或3 一磷酸一甘油醛与b F G F 一起孵育，发现糖基化修饰后的b F G F 促有丝分裂的活性分别下降7 3 ，7

54、 7 矛n 8 9 “。随着糖尿病病程的延续和非酶促糖基化反应的加速，骨骼肌内A G E s 逐渐第3 0 页天漳医科大学硕士研究生学位论文累积，持续作用于骨骼肌和内皮细胞，有可能导致其合成和分泌生长因子的能力下降及生长因子糖基化，导致其功能下降。糖尿病大鼠骨骼肌内源牲b F G F 蛋白下降可能由于以下机制：1 ) 高血糖可直接抑制骨骼肌b F G F m R N A 表达，注射链脲佐菌素后9 6 d , 时，骨骼肌b F G F m R N A比对照组低2 3 ，胰岛素治疗可逆转此改变”“。2 ) 根据特殊染色，骨髂肌肌纤维可以分成I 、I Ia 与I Ib - - 种类型。b F G F

55、 基因的阳性表达仅见于I 型与I Ia型纤维胞浆，b F G F 蛋白及其受体的分布也仅见于I 型与I I a 型肌纤维内膜。这一现象的发现提示b F G F _ 百 r 能对I 型与I Ia 型骨骼肌纤维胚胎发生和成熟后的表型维持起重要作用。糖尿病骨骼肌I 和I Ia 型纤维比例下降可能导致b F G F下降，而b F G F 下降又进步导致这两种纤维的再生发生障碍，其结果导致肌纤维表型与纤维类型比例发生改变，最终因I 和I Ia 型纤维减少而使组织出现肌无力以及收缩功能障碍口州。3 ) b F G F 在细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i x

56、 ，E C M ) 主要与硫酸乙酰肝素蛋白多糖( h e p a r a ns u l p h a t ep r o t e o g l y c a n s ，H S P G s )结合。E C M 亦就起着细胞：g - b F G F 蓄积池的作用。组织损伤后凝血酶和乙酰肝素酶从E C M 中快速释放出活性的H S P G b F G F 复合物。调节细胞的分化和增殖，以及伤后细胞修复的启动。b F G F 与E C M 之间的相互作用主要由H S P G s 介导。在b F G F 的分子结构中包含有多个分散的肝素结合区域，这些区域对H S P G s 和肝素样糖胺多糖具有高度亲和力，但这

57、些区域因富含赖氨酸残基而易发生非酶促糖基化反应，限制b F G F 与E C M 的结合，NJ 弱E C M X f f b F G F 蓄积池的功能，导致伤后不能迅速有效地释放出适量的b F G F ，影响伤后细胞修复的启动。因此，A G E s对基质的修饰，不仅可能会引起组织修复细胞支架的改变，而且亦会影响生长因子的储存和释放。”。如前所述，骨髂肌纤维损伤后的再生主要来自于卫星细胞的激活与分化，由于卫星细胞常紧贴于骨骼肌细胞膜表面，而b F G F 经骨骼肌纤维产生后又常储存于骨骼肌纤维内膜。因此，骨骼肌纤维产生b F G F 的能力以及分泌特征，对调控依附于其周围的卫星细胞活性，进而影响

58、骨骼肌纤维再生有重要影响。组第3 1 页天律医科大学顺十研究生学位论义织内源性b F G F 产生减少与破坏增加将埘机体产生严重不利影响。正常骨骼肌生睦需要b F G F 的参与，同时创伤修复中也需要b F G F 的作用，因此，我们认为糖尿病内源性b F G F 的破坏及b F G F 促有丝分裂能力的下降可能是糖尿病患者肌肉萎缩、肌肉无力的重要原因，同时也为外源性b F G F 应用提供了更加有力的实验依据。糖尿病患者的周围动脉病变发生率高，起病早，进展快，病情严重，病变多广泛累及膝以下。器官自身新生血管形成的能力决定血管阻塞的严重程度，特别是当存在广泛缺血时直接血运重建技术不能应用。在动

59、脉阻塞病理进展及侧支血管网逐步建立过程中，b F G F 和V E G F 起着极其重要的作用。与无糖尿病动脉闭塞比较，糖尿病肌肉闭塞血管周围侧支血管形成明显较少。我们通过免疫组化方法研究了缺血对于工F 常及糖尿病大鼠骨骼肌b F G F 及V E G F 的影响。F u 氏等通过原位杂交检测对照和损伤鼠骨骼肌缺血4 小时b F G F 基因表达。发现急性缺血引起内源性b F G F 的破坏，而且下调b F G F 基因表达。内源性b F G F下降是出于氧自由基激活和炎症引起生长因子破坏增加“。本研究通过结扎股动脉制造下肢缺血模型，应用免疫组化方法检测对照和损伤鼠慢性骨骼肌缺血b F G F

60、 蛋白表达。根据阳性染色，b F G F 阳性纤维为6 9 4 3 5 4 8 3 4 。在缺血骨骼肌b F G F 表达位点与正常骨骼肌相似，但b F G F 染色阳性在缺血骨骼肌为5 3 6 5 9 5 3 2 2 。这些结果表明慢性缺血诱导内源性b F G F 的破坏，同时我们发现糖尿病大鼠缺血肌肉b F G F 下降更明显为2 5 4 2 4 5 0 6 9 。内源性b F 6 F 基因表达的调节紊N L 丰I b F G F 蛋自的合成下降可能在延迟创伤愈合中超重要作用，高血糖使缺血状态下b F G F 进步下降可部分解释周围血管病变患者中糖尿病患者肌肉病变较重，新生血管减少的现象。