抗氧化酶SODPODCAT活性测定方法

1、抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四哩光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/L 磷酸缓冲液（PBS, pH7.8）:A 母液:0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4 12H2O （分子量 358.14） 71.7g；B 母液：0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4 2H2O （分子量 156.01） 31.2g。分别用蒸储水定容到 1000ml。0.05mol/L PBS （pH7.8）的配制：分别取 A 母液（Na2HPO4） 228.75ml , B 母液（NaH2PO4） 21.25ml，用蒸储水

2、定容至 1000ml。加入10gPVP （聚乙烯毗咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000: 267268。（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。 网上说定容到100ML我也不懂。拜托（3）100 卬 mol/L EDTA-Na 2 溶液：取 0.03721g EDTA - Na2 用磷酸缓冲液定容至 1000ml ;（4） 100叩 核黄素溶液：取 0.0075g核黄素用蒸储水定容至100ml，避光保存，随用 随配，并稀释10倍（5）750 mol/L氮蓝四哩（NBT ）溶液：称取0.

3、06133g NBT用磷酸缓冲液定容至 100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加 2ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml。取5ml于10000r/min下离心10min,上清液即为SOD粗提液。 提取酶液时如何保存；如果没有测完的需要放在 4C的冰箱里。2、酶活性测定2.显色反应取试管（要求透明度好） 5支，3支为样品测定管，1支为对照管，另外1支作为空白，按表 39-1加入各溶液。混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时

4、间可适当延长） 。表39-1 各溶液加入量试 剂(酶)用量(ml)终浓度(比色时)0.05mol/L磷酸缓冲液1.513mmol130mmol/L Met 溶液0.30.375mol10mol750 卬 mol/L NBT 溶液100 mol/L EDTA-Na 2 液0.320mol/L核黄素0.32.0 h mol空白和对照管加缓冲液代替酶 液蒸储水0.050.25酶液总体积3.0加核黄素时记得要快并且要避光，SOD活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm波长下的消光度值，已知SOD活性单位以抑制 NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD

5、活性：SOD 总活性=A0 -0.5x：FW XVi式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；A 0一照光对照管的消光度值；As一样品管的消光度值；Vt一样液总体积(ml);V1测定时样品用量(ml);FW-样重(g);蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g)。用荧光灯20w照20min可以吗 不可以，二、POD、CAT酶活性的测定粗酶液制备同SOD。1、过氧化物酶(POD )活性测定(愈创木酚法)(1) 试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液(pH6.0):分别取 A 母液(Na2HPO4 ) 61.5ml 和 B 母液(NaH2PO4 ) 438.

6、5ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M , pH6.0);(2) 反应混合液配制：取50ml PBS(100mmM , pH6.0),加入28ul愈创木酚(2-甲氧基酚)加热搅拌溶解，冷 却后加入19ul 30%的H2O2,混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：称取1g,放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以4000r/min离心15min,上清液转入100ml容量瓶，用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。取试管3支，一支取3ml反应液并加入磷酸缓冲液1ml作调零，两支取 3ml反应液并加入1ml酶液，立即计时，在 470nm测定，酶隔30s读书一次。测一个样加一个，不要全 部

7、加上。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每 min OD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。POD= （ A470x Vt / （WK VsXQ.01 & （u/g min） A470为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）; t为反应时间（min） ; Vt为提取酶液总体积；Vs为测定时取用酶液体积。2、过氧化氢酶（CAT ）活性测定（1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.0）:取 A 母液（Na2HPO4）61.0 ml 和 B 母液（NaH2PO4）39.0 ml

8、混合后至100ml。（加1gPVP）（2）反应液配制： 吸取5.68ml 30%的H2O2 （原液）稀释至1000ml,摇匀即可。（3）样品测定：1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入23ml 4 C下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量 石英砂研磨成匀浆后，转入 25ml容量瓶中，并 用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置4C冰箱中静置10min ,取上部澄清液在 4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4C下保存备用.2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管（加入酶液后在沸水中 煮沸5-10min

9、 ,冷却之后加入 H2O2测定吸光值），按表40-2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸收法测定 H2O2样品液配置表r 号粗酶液（ml）pH7.8 磷酸(ml)蒸储水（ml）S10.21.51.0S20.21.51.0S30.21.51.025 C预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2 ,每加完一管立即记时，并迅速倒入石 英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔 1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定 完后，按下式计算酶活性。调零用磷酸缓冲液（pH=7.8 ）3. 结果计算：以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。过氧化氢酶活性(u/g/min)= A

10、24 0x Vt/0. 1 x V1 x t x FW 式中 A240 = AS0 (AS1+AS2 ) /2AS0 一加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2 一样品管吸光值；Vt 一粗酶提取液总体积(ml);V1 一测定用粗酶液体积(ml);FW 一样品鲜重(g);0.1 A240每下降0.1为1个酶活单位(u);t 一加过氧化氢到最后一次读数时间( min)五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA 100g 三氯乙酸 1L0.6%TBA 0.6g硫代巴比妥酸，加少量氢氧化钠(1mol/l )溶解 用10%TC旋容100ml (避 光)1mol/l氢氧化钠；称4gNaOFR蒸储水

11、溶解定容 100ml 3、测定步骤：称取剪碎的试材1g,加入2ml 10%TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心(4000r)离心10min,上清液为样品提取液。3.显色反应和测定 吸取离心的上清液 2ml (对照加2ml蒸储水)，加入2ml 0.6%TBA 溶液，混匀物于沸水浴上反应 15min,迅速冷却后再离心。取上清液测定 532nm 600nm和 450nm波长下的消光度。(2)双组分分光光度法按公式可直接求得植物样品提取液中MDA勺浓度。用上述任一方法求得 MDA勺浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA勺含量：MDA浓度山ml/ L J m提取液

12、体积fJMDA. mol/g FW)=植物组织鲜重fg)C2(umol/L)=6.45*(D53D600卜 0.56*D450G 为MDA勺浓度；D450、032、D600分别代表450nm 532nm和600nm波长下的消光度值。七、可溶性蛋白含量的测定(考马斯亮蓝染色法)1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取 0.001g考马斯亮蓝，溶于 50 ml 90%乙醇中，加入100 ml 85% （W/V ）的磷酸（不懂），85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是 85%的磷酸，加 入100ml就行。再用蒸储水定容到1L,贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。（2） 100 g/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液：称取25mg BSA加水溶解后定容至 100 ml, 再从中吸取 40ml用蒸储水定容至 100 ml （也可取10mg BSA定容至100ml即为100 g/ml 标准BSA溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样 0.5g,用5ml蒸储水或磷酸缓冲液研磨提取。吸 取样品提取液1.0Ml,放入具塞试管中（每个样品设置两