牛乳和羊乳蛋白质差异比较及检测方法研究

1、 1滂压料技大学 申请工学硕士学位论文 论文题目: 牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究 申请学位级别:工学 所学学科专业:发酵工程 培养单位:生命科学与工程学院 硕士生:张歌 导师:宋宏新 年月2:,3牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究 摘要 乳与乳制品是一类营养丰富的理想食品,是人体重要的蛋白质来源,牛 乳和羊乳是两类重要的乳品工业原料,乳源的控制直接关系到乳与乳制品的 质量与平安问题。本文对牛乳和羊乳的蛋白质含量、种类、酶活、各蛋白组 分进行了比拟研究,这是乳品加工和乳源针对性检测的根底,并且建立了可 以高效准确地检测羊乳中掺入牛乳的.聚丙烯酰胺凝胶电泳法 .和非变性聚丙烯酰胺

2、凝胶电泳法.。 牛乳和羊乳蛋白质定量检测研究。通过凯氏定氮法、双缩脲 比色法和考马斯亮蓝法三种方法测定牛乳和羊乳中 蛋白质含量,测得的牛乳和羊乳蛋白质含量分别为:.±./和 ./,./和./,. /和.±./。三种测定方法所得到的结果均是羊乳蛋白质含量 高于牛乳。凯氏定氮法测定过程虽然比拟复杂,但通用性强且测定蛋白质有 非常好的重复性和准确性。双缩脲法常用来快速测定不需要特别精确的蛋白 质含量,考马斯亮蓝法灵敏度高,操作简便快速。可以根据不同的实验需要 选择不同的方法测定蛋白质含量。 牛乳和羊乳中主要酶活性检测研究。碱性磷酸酶是巴氏杀菌的指示酶, 对于消毒乳的卫生质量检查具

3、有十分重要的意义,乳过氧化物酶具有抗菌活 性,能够延长生乳的保鲜期。比拟牛乳和羊乳这两种酶活力的差异,通过磷 酸苯二钠法测定牛乳和羊乳碱性磷酸酶活力,鲜牛乳和鲜羊乳分别是. ±.和.±.,巴杀牛乳和巴杀羊乳分别是.±. 和.±.,通过比色法测定牛乳和羊乳过氧化物酶活力, 鲜牛乳和鲜羊乳分别是.±.和.±.,巴杀牛乳和巴 杀羊乳分别是.±.和.±.,复原牛乳和复原羊乳均 已失去碱性磷酸酶活力和乳过氧化物酶活力。检测结果说明,牛乳的碱性磷 酸酶活力和乳过氧化物酶活力均高于羊乳。 牛乳和羊乳蛋白质的别离制备。采用等电点沉

4、淀法,通过洗涤、枯燥等 步骤别离制各牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳中的酪蛋白,利用凝乳 酶别离制备鲜牛乳和鲜羊乳中的酪蛋白。用凯氏定氮法测得鲜牛乳和鲜羊乳 别离制备的酪蛋白纯度分别为.%和.%,得率分别为.%和4.%。采用等电点沉淀、微滤、超滤、冻干等方法别离制备牛乳和羊乳中 的乳清蛋白,三氯乙酸沉淀法制备巴杀乳及复原乳中的乳清蛋白。采用离心、 乙醚浸提等方法制备鲜牛乳和鲜羊乳中的脂肪球膜蛋白。 牛乳和羊乳蛋白质的电泳分析比拟研究。乳中蛋白质种类多,且含量丰 富,主要包括酪蛋白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋自等,酪蛋自由。.、 .、和组成,乳清蛋白包括.乳球蛋白、孚白蛋白、血 清白蛋白、免疫球蛋白、

5、乳铁蛋白等。采用.方法分析检测全乳 蛋白及制备出的牛乳和羊乳酪蛋白、乳清蛋白及旨肪球膜蛋白,比拟牛 乳和羊乳蛋白质的差异及特性。图谱显示高含量的酪蛋白主要集中在电泳 图谱的中分子量组,羊乳.分子量大于牛乳,牛乳.含量高于 羊乳,牛乳洳含量比拟多,羊乳.含量比拟多,牛乳轻链的分 子量较羊乳小,上端的高分子量组清蛋白区羊乳重链的分子量比牛乳 小,牛乳比羊乳多一个脂肪球膜蛋白条带。采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电 泳.分析检测牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳、乳清 蛋白组分,比拟差异。由电泳图谱可以看出,牛乳比羊乳在低分子量区多 两个蛋白条带,差异明显,可以作为检测羊乳中掺入牛乳的特征蛋白。采 用.方法和方

6、法检测羊乳中掺入不同浓度的牛乳, 结果说明,当羊乳中掺入%牛乳时,在电泳图谱中就可以看出明显差异。 本研究通过比拟牛乳和羊乳蛋白质含量、乳酶活力、各蛋白组分分子量 差异,为快速准确区别牛乳和羊乳提供了理论根底。建立的.方 法和.方法对于检测羊乳中掺入牛乳具有较好的重复性和准确 性,为检测羊乳掺假提供了理论依据,混合乳检测方法确实立能够保证消费 者的利益,保护我国乳品行业健康开展,并且检测方法确实立也是食品检验 和执法部门目前需要解决的重要问题。 关键词:牛羊乳差异,酪蛋白,乳清蛋白,乳酶活性,聚丙烯酰胺凝胶电泳5. .巧. .?.血 ., ./ ./,./ .匕. /,./ ./ .砀 . ,

7、. ., .。,墩.【. ,. .:., 6. .士. ,. .:. .:.,. .士. ,嘶. ., ,廿,.% .%, .% .% . , ,.,.【 ,.?一, ?; , , .?.,.?. .,. ,7. ,. .%. ,. ?.: , ,8英文缩写 【. .? ?匹匝波 符号说明 英文全名 中文译名 【. 【.乳白蛋白 .乳球蛋白 硒.酪蛋白 .酪蛋白 静酪蛋白 免疫球蛋白重链 免疫球蛋白轻链 牛血清白蛋白 道尔顿 毛细管电泳 微过滤 超过滤 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰铵凝胶电泳 高效液相色谱 , 四甲基乙二胺 聚合酶链式反响 丙烯酰胺 过硫酸铵 .甲叉双丙烯酰胺 碱性磷酸酶 乳过氧化

8、物酶 9目录 摘要?. 瞰?. 符号说明 前言?. .课题研究的目的和意义 .牛乳和羊乳蛋白质.酪蛋白?. .乳清蛋自. .乳脂肪球膜蛋白. .国内外研究现状 .凯氏定氮法?. .其他快速测定蛋白质的方法?. .乳中的酶. .电泳检测技术? .主要研究内容和技术路线?. .课题主要研究内容.研究总体设计思路牛乳和羊乳蛋白质总量及乳酶活力的测定 .实验内容和技术路线. .凯氏定氮法测定牛乳和羊乳中的蛋白质含量?. .引言?. .实验材料 .实验仪器 .试剂的配制.实验方法 .结果与讨论.双缩脲比色法测定牛乳和羊乳蛋白质含量. .引言?. .实验材料 .实验仪器. .试剂的配制。.实验方法. .结

9、果与讨论.考马斯亮蓝法测定牛乳和羊乳蛋白质含量. .引言?. .实验材料 .实验仪器 .试剂的配制。实验方法 .结果与讨论.碱性磷酸酶活力的测定?.10.磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活力? .材料与仪器.试剂的配制.操作步骤 .结果与讨论.乳过氧化物酶活力的测定?。 . 比色法测定乳过氧化物酶活力 .材料与仪器.试剂的配制.操作步骤 .结果与讨论.本章小结?. 牛乳和羊乳酪蛋白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋白的别离制备? .引言及技术路线?. .牛乳和羊乳酪蛋白的别离制各及其纯度测定?. .材料与仪器.鲜牛羊乳酪蛋白的制备 .牛乳和羊乳酪蛋白纯度及得率的计算 .巴杀乳中酪蛋白的制备 .复原乳中酪蛋白的

10、制备 .利用凝乳酶别离制备鲜牛乳和羊乳中的酪蛋白.牛乳和羊乳乳清蛋白的别离制备?. .材料与仪器.鲜牛乳和鲜羊乳乳清蛋白的制备.巴杀乳、复原孚清蛋白的制备.牛乳和羊乳脂肪球膜蛋白的别离制备?. .材料与仪器.实验步骤 .本章小结?. 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析检测乳品及羊乳掺假研究.引言及技术路线?. .原理?. .材料与仪器?。 .实验材料 .实验仪器 .试剂的配制.实验步骤?. .检测结果及分析一 . .确定制备的酪蛋白最适浓度。. 】检测牛乳和羊乳及其酪蛋白结果 . .检测牛乳和羊乳及其乳清蛋白结果. .检测鲜乳、巴杀乳、复原乳全蛋白组分 . .检测制备出的牛乳和羊乳酪蛋白结果? .检测制备

11、的鲜乳、巴杀乳、复原乳乳清蛋白结果.检测脱脂乳、酪蛋白、乳清蛋白结果?.检测乳脂肪球膜蛋白结果.检测羊乳中掺入牛乳结果.非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.试剂的配制.实验步骤.检测结果. .检测羊乳中掺入牛乳结果及分析?.本章小结?.实验总结.课题结论?.牛乳和羊乳蛋白含量及酶活比拟研究.牛乳和羊乳各蛋白组分的别离制备?.法分析比拟牛乳和羊乳差异及羊乳掺假研究.展望?.致射.参考文献攻读学位期间发表的学术论文原创性声明以及关于学位论文使用授权的声明牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究丽看.课题研究的目的和意义乳与乳制品是一类营养丰富的理想食品,是人体重要的蛋自质来源【。牛乳和羊乳是两类重要的乳品工

12、业原料。牛乳营养丰富,所含有的营养价值几乎全部能被人体消化吸收,并且具有促进生长发育,提高人体免疫力等生理功能,曾被西方医学之父希波拉底称之为最接近完美的食品闭。现代医学研究说明,羊乳含有丰富的蛋白质、脂肪、乳糖、矿物质及多种维生素。羊乳以其营养丰富、易于吸收等优点被视为乳品中的精品,被称为“奶中之王,是世界上公认的最接近于母乳的乳品,是现代人健康的营养佳品。羊乳的总营养价值高于牛乳,其中干物质营养含量一般比牛乳高%左右,比母乳高%左右。羊乳与母乳的各项营养元素配比均非常相近,且羊乳有含量较高的免疫球蛋白,在一些有效成分上远远比母乳高。随着人们对羊乳营养价值的了解及对羊乳风味的接受,羊乳加工的

13、产业化、规模化必将成为趋势。目前我国乳业消费仍以牛乳为主,品种单一,市场竞争力较差。山羊奶被认为是人类的三大奶源之一,是羊乳的主要来源,被誉为“不用冰箱的奶库和“贫民的奶牛与聚宝盆,世界上一半以上的人饮用山羊奶。羊乳有较小的脂肪球和较大的乳酪蛋白胶束,羊乳和牛乳相比更易凝乳,更易消化吸收,更适于对牛乳过敏者食用。在西方已把山羊奶列为疗效食品叫。因此,开展山羊奶产业不仅是对中国奶业数量上的补充,而且在品质上与牛奶相比更具潜力。但是,奶山羊是典型的短日照季节性繁殖动物,产奶期一般为月份,月份为不产奶期【羽。一头奶牛的日产奶量在公斤左右,一头羊的日产奶量在公斤左右】。羊乳产量不高,季节性波动大,而且

14、价格较牛乳贵,羊奶及其制品的价格要比牛奶高一倍多【】,一些不法商贩便在利益带动下昧着商业道德将过剩的牛乳掺入羊乳中鱼目混珠来降低本钱,侵害消费者权益,也使乳制品生产厂家遭受巨大的损失。现在多种多样的羊奶制品已经遍布市场,主要包括奶粉、液态奶、酸奶、奶片等?】,羊奶制品的生产、加工、销售在国际市场上增长趋势迅猛。在欧美等国家,羊奶及其制品在人们日常生活中占据了重要位置,已经到达%以上的市场占有率。专家建议婴幼儿、患有过敏症、胃肠疾病及身体虚弱的人群等适宜饮用羊奶。目前在我国羊乳的高营养价值已经被人们所熟知,随着脱膻技术的开展成熟,羊乳已逐渐成为人们喜爱的健康饮品。我国的乳品工业开展很快,但是原料

15、基地分散、养殖规模小且很不稳定,养殖从业人员的业务素质及职业道德有待提高。此外,由于利益的驱动,原料乳掺假现象越来越陕西科技大学硕士学位论文严重,从原始的掺水、混入水解后的植物蛋白等手段转向其它掺假方式,技术愈发隐蔽,让人很难分辨真假。除此之外由于羊乳生产企业乳源产量小、高度分散等方面的特殊性,促使企业想要生产纯的羊乳粉就从源头陷入难以控制的局面。并且由于羊乳蛋白质的种类,含量,结构等方面都与牛乳不同,因此牛羊乳的检测方法各异。由于牛乳和羊乳性质相似,羊乳中掺入一定量的牛乳从感官及其常规指标上都很难检测出来,现场使用诸如色谱仪,毛细管电泳仪等高精尖设备又很难实现,因此从保证企业生产到保护消费者

16、利益等方面考虑都急需建立健全相应的检测方法及标准。目前,国内外针对牛乳中掺入淀粉,糊精,明胶粉等非乳源物质的研究报道很多,方法成熟,并且也有相应的仪器设备,但是国内外却很少报道羊乳及其制品中掺入牛乳等乳源性成分的检验方法,这是值得研究的掺假检验新问题。因此为了保障羊乳及其产品的品质,确保乳制品生产厂家及消费者的利益,研究牛羊乳的区别越来越重要,寻求一种快速准确的羊乳中掺入牛乳的检测方法非常有必要,并且检测方法确实定也是食品监督局和执法机构目前需要解决的重要问题。同时对于保护富有特色的羊乳及其制品市场,完善国家乳制品标准、法规及检测方面都具有十分重要的意义。本课题的目的是别离制备出牛乳和羊乳酪蛋

17、白、乳清蛋白及乳脂肪球膜蛋白,从蛋白质种类、含量、性质等方面进行差异比拟,从中找出能够快速区别牛羊乳的方法。意义在于为快速准确区别牛羊乳,为检测羊乳掺假提供根底的理论依据,混合乳检测方法确实立能够确保消费者和乳品生产厂家的利益,使我国乳品行业健康开展。.牛乳和羊乳蛋白质乳品是营养价值最全面的食品之一,乳主要由蛋白质、乳糖、乳脂、水、碳水化合物、矿物质和维生素等构成,而乳蛋白又是乳中最主要的营养物质之一,是乳及很多乳制品中的主要成分,是乳制品的重要指标之一,也是人类膳食蛋白质的重要来源,它和乳中的酶类对乳制品的物理化学性质都有作用。乳中的蛋白质主要由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白等很多种类组成

18、,且含量丰富,分布广泛,乳中蛋白质含量为.%.%。酪蛋白包括.酪蛋白、酪蛋白、.酪蛋白和十酪蛋白种,丫酪蛋白实际上是乳中蛋白酶分解.酪蛋白产生的,因此实际上乳中酪蛋白类型只有前种。牛乳和羊乳中各种蛋白质的种类及含量见表.。.酪蛋白酪蛋白以占乳中蛋白质总量的五分之四而成为牛羊乳中最主要的蛋白质,酪蛋白是一种具有热稳定性和柔性的蛋白质,大局部的存在状态为酪蛋白胶束,常温下在水中的溶解度为.%一.%,能溶于酸和碱,浸入水中后那么迅速膨胀【】。酪蛋白在乳中以酪蛋白.磷酸钙胶束的形式存在,是两性蛋白质,具有磷酸化作用,胶束中的蛋白质占到%,另外%主要是磷酸钙。当乳的值为.时,胶束带负电荷,带正电荷的离子

19、能牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究表牛羊乳蛋白质的种类与含量【.够被吸引会聚在胶束表层,形成蔓延的双电子层,因而比拟固定。目前酪蛋白胶束主要功能应用于食品原料或微生物的培养基中,酪蛋白磷酸肽是蛋白质酶促水解的产物,它具有预防龋齿、防止矿物质流失、防治骨质疏松、控制血压、医治缺铁性贫血等各种治疗效果,在提高如、等常量元素和、等微量元素消化吸收方面的效果最显著,所以被冠以“矿物质载体的美誉。羊乳与牛乳在蛋白质种类与含量方面十分相似,但羊乳的.酪蛋白缺少脯氨酸.和酪氨酸.两个氨基酸残基【持,羊乳中仍然是酪蛋白含量占主要比例,但其含量比牛乳稍低,并且在很大程度上与牛乳不一样,比方沉降速度较低,

20、.酪蛋白难溶于水,胶粒体积较小,能够结合较多的钙与磷以及热稳定能力不强等。牛乳和羊乳中的酪蛋自由.酪蛋白、.酪蛋白、酪蛋白、静酪蛋白组成【】,其中羊乳.酪蛋白的含量最高,占酪蛋白总量的%四相对含量。乳中的酪蛋白对于过敏体质群体来说是主要的过敏原。乳中的酪蛋白是一种特征性蛋白质组分,其含量一般受季节、饲料等因素的涉及比拟小,相同品种的奶牛与山羊在此方面的含量总的来说比拟恒定【砌。酪蛋白的含量在原料乳和乳制品干酪、酸奶、婴儿配方乳粉中是一个重要的质量指标,因此可以用来鉴定乳品掺假,但是,乳制品容易出现诸如脂肪上浮、蛋白质沉淀、絮凝或分层等胶体分散体系不稳定的现象,从而严重影响产品的质量,解决这些问

21、题的核心就是要控制酪蛋白的稳定性,因此对酪蛋白的研究变得十分重要而且很有必要。.乳清蛋白乳清中蛋白质种类多、多数清蛋白含量低,局部清蛋白有重要的酶过氧化物酶、溶菌酶活性,这些少量蛋白和酶对乳的性质、开发利用、保鲜都起着很大的作用。酪陕西科技大学硕士学位论文蛋白沉淀后,上清液仍有许多蛋白质组分,它们的总称即为乳清蛋白,它占乳中蛋白质总量的五分之一,含量比酪蛋白低,主要包括%.乳球蛋白、%.乳白蛋白、%免疫球蛋白、%血清白蛋白均为质量分数、少量的乳铁蛋白、糖基肽、微球蛋白及生长因子等。其中乳清蛋白的主要成分是.乳球蛋白和.乳白蛋兰,它们也是主要的过敏原。乳清蛋白具有高分散度、较强的水合能力、乳化性

22、及搅打起泡性,可广泛应用于食品、医药、工业等领域。乳清蛋白能够发生相互作用并且凝集【】主要是因为含有较多的巯基和二硫键,加热使其多肽链伸展并发生变性,激活巯基后导致分子间的二硫键互相交换。乳清蛋白具有较高的蛋白质含量、营养价值及生物学效价,但脂肪和胆固醇含量却很低,被营养学界冠以“蛋白质之王【捌的美称。因为乳清蛋白的总营养较高,目前市面上有很多乳制品都强调具有强化乳清蛋白的功能,出现了例如功能性蛋白保健品、多成效配方奶粉等有助于强化乳清蛋白的产品,因此为了评价乳制品中是否添加了标准所要求的乳清蛋白,迫切需要找到能够用来高效准确地测定产品中乳清蛋白含量及特性的方法。.乳脂肪球膜蛋白乳脂肪球膜蛋白

23、是一组膜结合蛋白,是吸附于脂肪球外表的蛋白质,与磷脂一起构成脂肪球膜,分子磷脂质约与分子蛋白质结合在一起。因为乳脂的分泌形式是顶浆分泌,所以上皮细胞释放出被乳脂小球裹住的质膜至乳腺腺泡腔中,被分泌到乳中的还包括与膜结合的蛋白刚。乳脂肪球膜主要由黄嘌呤氧化复原酶、嗜乳脂蛋白,、乳脂肪球外表生长因子.种膜蛋白饼】构成。其中的乳肪球外表生长因子就是一种乳脂肪球膜蛋白,它的重要作用是在乳腺分泌乳的末期及衰败和退化过程中除掉已死亡的乳腺细胞。蛋白质、脂质、酶类、糖类、维生素及核酸等物质构成乳脂肪球膜蛋白,其中脂质和蛋白质是主要成分,占其含量一大半。一百克乳脂肪中含有.的脂肪球膜蛋白质,主要成分含量的变化

24、受到的各种影响因素包括别离方法、动物品种、泌乳期、季节等。其中乳脂肪球膜蛋白是乳中蛋白质的一局部,通过分析其构成,有助于全面认识乳蛋白的组成及乳腺机能瞵】。脂肪球膜蛋白在乳中虽然含量甚微,但是却具有非常重要的生物学意义。.国内外研究现状对牛乳蛋白质的研究,国内外已有很多报道,但对羊乳蛋白质的报道较少,且因研究方法、产地、饲养情况、泌乳期等不同,测定的结果也不相同。目前对于牛乳和羊乳主要是从理化性质、营养成分等方面进行比拟,对牛羊乳蛋白质等方面的比拟很少。国内外对于蛋白质的检测技术主要有电泳技术、色谱技术及免疫学技术。酪蛋白、乳球蛋白、.乳白蛋白的别离纯化方法主要有盐析沉淀法、等电点沉淀法、离子

25、交换色谱、疏水作用色谱、羟基磷灰石色谱、膜技术、凝胶过滤及高效液相色谱等。乳清蛋白的分牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究离方法主要有三氯化铁和氯化钠盐析法、硫酸铵法多级别离、凝胶过滤法、等电点和多聚磷酸盐沉淀法等。.等测得羊乳和牛乳中酪蛋白氮、非蛋自氮及乳清蛋白氮分别为.,.,./,.,.,./。郭明假设等【】对西农萨能羊、英国萨能羊和关中奶山羊的蛋白质含量进行了测定,分别为.%、.%和.%,并测得钙含量高于牛乳一倍,不饱和脂肪酸含量高于牛乳。石燕等【町利用毛细管电泳测定牛乳和山羊乳混合乳的蛋白质,较好的实现了牛乳和山羊乳混合乳中蛋白质的分析检测,结果说明牛乳的嬲.、一:、. 及山羊乳的

26、.、能够作为定性测定的酪蛋白。刘蒙佳等口】对羊乳和牛乳的理化特性做了分析比拟,羊乳的脂肪、蛋白质、干物质、灰分和非脂乳固体都显著高于牛乳,羊乳和牛乳氨基酸组成.大致相同,但是两者的含量有明显差异,羊乳的变化范围为.。等人在相同的条件下分析比拟了羊乳和牛乳包括蛋白质、脂肪、矿物质等方面的组成,用凯氏定氮法测得蛋白质含量分别为.%和.%,用高效液相色谱法分析氨基酸组成,两者虽然有一此差异,但必需氨基酸总量无显著差异。白英等人别离并测定山羊.酪蛋白的含量,通过对沉淀蛋白进行离子交换层析,别离出【.酪蛋白和.酪蛋白,并且.酪蛋白被完全纯化出来,建立双夹心方法对.酪蛋白的含量进行测定。王玉琴等对河南奶山

27、羊乳酶活力和乳蛋白组分进蛋白组分进行了分析。李萌等用方法定量检测了牛乳中的蛋白质含量。高巍等人九用法测定牛乳蛋白质,采用%别离胶,电压,较高灵敏度染液煮沸染色,振荡后即能快速别离得到牛乳蛋白质。尹睿杰别离.、酪蛋白及复合物主要采用酸沉、酶凝、离心及膜别离的方法,使.得率最大化,实验得出别离牛乳中的.采用膜别离法的得率与纯度较高,最后得到浓度为./的.乳白蛋白,.阴离子交换色谱和饱和硫酸胺盐析法两种方法综合起来使用,用间接竞争法检测.乳白蛋白和.乳球蛋白。,.等人测得羊乳酪蛋白的等电点不是.,而是,此时牛乳和羊乳在酪蛋白的种类上,羊乳含有较多的.,牛乳.含量比拟多,母乳不含.,羊乳含有微量的.,

28、所以与牛乳比拟羊乳与母乳研非常近似。对牛羊乳的蛋白质组成进行了分析研究,结果说明有一些差异存在于这两个物种之间,且同一物种基因不同也有差异,同时饲养方式、泌乳期、气候等因素的影响,结果也有差异,并且这些差异也会由不同的标准和检测方法【柏】造成。有关于羊乳中掺入牛乳检测方法的研究报道最近几年来有很多,对于羊乳中掺入牛陕西科技大学硕士学位论文乳成分的检测技术国外的研究起步比拟早,综合起来,主要是以羊乳与牛乳的脂肪酸组成色谱技术、蛋白质分子构成电泳以及免疫学方法及细胞技术来进行检测,见表。表.羊乳中掺入牛乳成分的检测技术 .蛋白质的测定方法.凯氏定氮法日前主要有两大类蛋白质测定方法,一类是利用诸如肽

29、链、氮含量及紫外吸收等蛋白质的共性进行测定,另一类是利用蛋白质的酸碱性、芳香基团及特定氨基酸残基等特性进行测定。多种多样的食品中蛋白质含量各不相同,例如维生素、脂肪、碳水化合物等其它成分的干扰较多,因此所需的测定方法也不同。凯氏定氮法属于我国国标法,是国标法中最重要和最权威的方法,操作分为待测样品的消化、蒸馏、吸收和滴定个步骤。采用浓硫酸加热破碎样品中的有机物,使用硫酸铜作为催化剂,样品中的蛋白氮及其它有机氮的状态即会转变成氨形式的氮,随后氨态氮与硫酸作用生成硫酸铵,在凯氏定氮仪中放入强碱氢氧化钠采用酒精灯加热进行蒸牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究馏,蒸出氨后用硼酸溶液吸收,最后用标准

30、酸滴定,得到样品中的含氮量,用氮的量乘以换算系数乳品中的换算系数为.,即可计算出试样中的粗蛋白质含量刚。凯氏定氮技术虽然比拟精确、可靠,但是也有一些缺点,例如:操作复杂费时,灵敏度比拟低;操作过程较危险,比方毒烟、滚烫的浓硫酸和具有腐蚀性的强碱溶液;较严重的环境污染,要求实验室具有良好的排风系统和化学废物的专业处理。.其他快速测定蛋白质的方法凯氏定氮法是最根本的生化研究分析方法之一,但是测定过程比拟复杂费时。为了到达快速分析检测、缩短实验时间、防止环境污染、高效准确测定等目的,许许多多其它能够便捷测定蛋白质的方法逐渐诞生,这些方法的共同特点是使用分光光度计在特定波长下进行比色测定,核心是蛋白质

31、的化学显色反响、蛋白质的染料染色反响以及蛋白质本身的紫外光吸收,如双缩脲法【、福林.酚法、法【】、考马斯亮蓝法【】等,特点是多数反响是针对蛋白质分子本身,但是如何防止干扰物质,提高检测的灵敏度及提高反响特异性是关键。双缩脲法法:双缩脲.与碱性能够形成紫红色的络合物,将此命名为“双缩脲反响。蛋白质中有许多个肽键,也能与:发生双缩脲反响,且颜色深浅与蛋白质含量在一定范围内符合比尔定律,可以用比色法进行测定。双缩脲法是测定蛋白质的的常用方法之一,双缩脲反响主要与肽键有关,因此很少受蛋白质特异性的影响,并且此测定方法所用试剂廉价易得,操作简便,可测定范围的蛋白质,但受干扰物质较多,适用于快速测定精度要

32、求不太高的蛋白质含量。科学家们因为双缩脲法法的缺乏和应用范围窄等方面的原因试图去探索高效的方法来测定蛋白质的含量。由于年建立的考马斯亮蓝法是根据考马斯亮蓝.在游离状态下呈红色,与蛋白质结合那么呈现蓝色,同时染料.蛋白质复合物的最大吸收峰由变成,溶液的颜色由红变蓝这一原理设计的。这种测定蛋白质的方法能够得到广泛的应用是因为具有其他几种方法无法超载的突出优点。它是目前测定蛋白质灵敏度最高的方法之一。变化范围较大,因而消光系数较高,吸光度值便具有较大的蛋白质浓度变化。操作简捷快速,试剂配方简单。一个样品只要分钟就能测定完,染料与蛋白质分钟内完成结合,颜色能够稳定小时,但.分钟之间稳定性最正确。干扰物

33、质较少,干扰双缩脲法的物质均不干扰此测定法,蛋白质间的变动也较小,是一种常用的蛋白质快速微量测定方法。此法的缺点是:法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差,因为不同蛋白质中的芳香族氨基酸和精氨酸含量各异。因此一般选择球蛋白作为标准蛋白质来绘制标准曲线,以此来提高精度。存在少量的干扰物质,比方.、陕西科技大学硕士学位论文去污剂、十二烷基硫酸钠等。标准曲线的线性关系不太好,因此测定样品蛋白质含量时不能使用比尔定律计算。以上三种蛋白质测定方法没有完美无缺的,都有其优缺点。双缩脲法的优点是试剂廉价,容易配置,缺点是灵敏度低;考马斯亮蓝法测定范围为,优点是灵敏度高,操作简便快速,缺点是碱性缓冲液干扰分析,受

34、去污剂干扰如。以上三种测定方法的比拟见表.。表三种常用蛋白质含量测定方法比拟由表.可知,考马斯亮蓝法灵敏度最高,其灵敏度是双缩脲法的倍。因此考马斯亮蓝法的应用宽广,但双缩脲法和考马斯亮蓝法也不能对任何蛋白质都通用,即不能用来随意测定蛋白质,对于同一种蛋白质样品假设同时用此两种方法测定,得到的结果也有可能不相同,因此测定蛋白质含量时应综合考虑以下因素:精度、灵敏度;蛋白质性质;干扰物质;材料费、仪器等花费。以上三种方法都可以用于测定乳及乳制品中的蛋白质含量,实验过程中可以根据不同的需要选用不同方法进行测定。.乳中的酶乳中含有许多有活性的酶类,其中有一些存在于乳清蛋白中。乳中的酶类物质主要分为内源

35、酶也称固有酶和外源酶【羽。乳中含有多种内源酶,主要来源于乳腺组织、血浆及白细胞。乳中存在的绝大多数酶对于乳本身没有功能,只有一小局部酶与乳发生作用,因此在存储乳的过程中其风味、理化性质,乳制品的生产和质量等【】都会受影响。乳中的酶主要包括过氧化物酶、磷酸酶、溶菌酶、乳酸脱氢酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶等,不同的乳中酶的活力也不同。这些乳酶的含量很少故很难别离,检测时可直接将牛乳、羊乳或制成的乳清理化体系未变作为原液载体来检测。牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究磷酸酶可水解磷酸酯键,释放磷酸基团。磷酸酶可广泛用于高温短时杀菌效率的指示,其对乳品技术、质量和平安均具有重要意义。乳中磷酸酶主要是

36、碱性磷酸酶,简称和酸性磷酸酶,碱性磷酸酶存在于所有的动物乳中,不同乳中其酯酶,碱性磷酸酶在乳中以能够测定到的水平存在,其存在量和杀菌密切相关,抗热能力比乳中存在的病原菌稍高,如果巴杀后全部的致病微生物都被杀死嘲说明巴氏杀菌后已经失活。假设巴氏杀菌后还存在酶活说明没能完全进行巴氏杀菌或巴杀乳中混入了原料乳,因此对卫生平安来说是一个特征标志。碱性磷酸酶在正常的乳中存在,当乳进行杀菌后,其不存在或已失活。检测碱性磷酸酶对于鉴定消毒乳的卫生及质量都有非常重大的作用,它能鉴定消毒乳成品的消毒程序是否恰当,及原料乳是否经过了严格的消毒杀菌程序,以此来保证乳中隐藏的有害菌能够完全被消灭。乳过氧化物酶,简称相

37、对分子质量为,在乳清蛋白中可见,同时它还是乳汁中的一种血红素蛋白,是乳中固有的一种抗菌活性酶类。它是一剂,以此确保机体粘膜遭遇微生物的损害嗍降低,是机体防御体系的一局部。其特性是对热稳定,低温巴氏杀菌不能使其失活。乳过氧化物酶在乳中的存在状态是乳过氧化物酶体系 ,简称它能够使大量微生物的生长及代谢活动受到抑制或消失嘲,这种抗菌保鲜体系纯天然且生活中的使用价值较高。这个酶系统具有抑菌活性,可以在没有冷藏的条件下,抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长,延长鲜乳的保持期,具有冷杀菌作用州。从而到达抑制或杀灭乳中细菌,延长生乳保鲜期的目的嘟】。该方法具有保鲜效果好、时问长,对人体无害等优点,并且不影响乳制品

38、质量。乳中的不仅具有抗菌作用,还可预防等过氧化物的积累,从而防止了过氧化物引起的细胞损伤,起到保护乳腺的作用。乳过氧化物酶体系在乳中的抗菌保鲜能力非常强,能够提高原料乳的储存期限,以此完成鲜乳在采收、运输过程中由于温度高及卫生条件差所发生的奶酸败变质问题。利用乳过氧化物酶体系延长生鲜乳储存时间的方法,是目前除冰箱冷却贮藏外最正确的保存方、法【】。.电泳检测技术我们将有电物质在电场中朝着与其本身带电荷相异的电极移动的现象称为“电泳,。电场中利用带电粒子移动速度的不同而到达别离目的的技术称为电泳技术。在.年早期,胶体粒子具有电泳这一现象就被人们所发现,研究胶体化学时就开始运用这一实验现象。但是世纪

39、中期开展一直比拟缓慢。直到世纪年代,成功运用纸电泳技术后,此项技术才逐渐快速开展且被应用于各项领域。电泳仪被瑞典科学家研究出来并应用于探索蛋白质方面的知识后,电泳技术才慢慢陕西科技大学硕士学位论文涉及于生物化学领域中的研究。电泳技术通常以有无支持物进行分类【醅】,在溶液中不使用支持物进行的电泳称为自由电泳,有支持物的电泳那么称为区带电泳。前者用于一些较特殊的研究中,而区带电泳那么是应用最广泛的实用电泳技术。各种不同电泳技术都具有以下特点:应用任何一种电泳技术都可以实现带电物质的别离,并且能进行定性或定量分析;分辨率高;样品用量特别少;操作简便省时;可以在常温下进行实验;设备比拟简单。电泳方法有

40、很多种,可以根据支持物的不同分为纸电泳、凝胶电泳、聚焦电泳、毛细管电泳及醋酸纤维薄膜电泳等。聚丙烯酰胺凝胶为聚丙烯酰胺凝胶电泳提供支撑材料。这种凝胶具有弹性好、透明、机械强度好、没有吸附、电渗作用小、化学性质稳定、对和温度变化小等特点,是一种很好的电泳支持介质。聚丙烯酰胺凝胶的聚合是在催化剂作用下由丙烯酰胺,单体和.甲叉双丙烯酰胺交联剂形成。聚丙烯酰胺凝胶聚合后能形成网状结构,具有电荷效应电泳物质所带电荷的差异性和分子筛效应凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致。聚丙烯酰胺凝胶电泳分为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.根据蛋白质的分子量、形状、电荷来别离蛋白质和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.蛋白质的别离取

41、决于亚基分子量。按照是否有浓缩效应将电泳分为连续和不连续电泳两大类,连续电泳体系具有连续的缓冲液离子成分、值及凝胶浓度,带电物质在电泳仪中主要靠分子筛效应及电荷泳动。不连续电泳中由于具有不连续的缓冲液离子成分、值、凝胶浓度及电位梯度,电场中带电颗粒泳动就具有电荷、浓缩和分子筛三种效应,因而别离得到的条带清晰度及分辨率均比前者好,是最常用的体系。不连续体系组成包括浓缩胶、别离胶及电极缓冲液。浓缩胶是由催化聚合而成的大孔胶,待测样品在胶中浓缩后按迁移率降低依次慢慢在浓缩胶与别离胶的分界线上聚集成一蓝色条带,凝胶缓冲液为.的.,蛋白质分子在孔径大的胶中阻碍少,能够快速移动。浓缩胶中的呈弱酸性环境,因

42、此甘氨酸解离少,电场作用下样品泳动效率低,而氯离子浓度却很高,导电性较低的区带在两者之间形成,蛋白分子便在此两者之间泳动。由催化聚合而成的小孔胶便是别离胶,样品进入孔径小的胶后阻碍变大,迁移率变小。因为浓缩胶与别离胶是分开的,样品在大孔胶和小孔胶界面处就会被压缩变成一蓝色窄带,凝胶缓冲液为,的.。电极缓冲液是.的.甘氨酸缓冲液。由于电场强度与导电性不成正比,比拟高的电压梯度便在这一区带形成,促使蛋白质分子会聚在一块,压缩后区带狭窄。当样品进入.的别离胶后,由于胶中的增加,大量甘氨酸解离,泳动速率因而增加,直接紧随氯离子之后,样品不再受离子界面的影响,此条件下的电位梯度均衡,进行别离仅按电荷及分

43、子筛效应。两种缓冲体系、两种凝胶孔径、三种值使不牛乳和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究连续系统形成缓冲液离子成分、凝胶孔径、值的不连续性删浓缩样品。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,.可以使样品蛋白质的组分进行别离,并且可以检测样品蛋白质亚基的分子量。与连续缓冲系统相比拟,不连续系统分辨率比拟高,因此一般采用的是不连续缓冲系统。当足够量的和巯基乙醇能够断裂半胱氨酸残基之间的二硫键,这样别离出的谱带即为蛋白质亚基参加蛋白质溶液后,等于年发现十二烷基硫酸钠阴离子去污剂具有这种作用。分子被解聚成组成它们的多肽链,带负电荷的蛋白质.复合物是由氨基酸侧链与充分合并后生成的;蛋白质分子原本的电荷量

44、比蛋白质.复合物所带的负电荷低,因此相异分子之间本身的电荷差异被消圆棒状结构,各种各样物质的蛋白质.复合物短轴长度都为,长轴长度正比于蛋位长度上的电荷相等,所以它们在浓缩胶中的迁移速度也同样相等,进入别离胶后,由于聚丙烯酰胺胶具有分子筛效应,分子量小的蛋白质阻碍小,能够快速移动,经过凝胶孔径非常便捷;分子量大蛋白质因为受到的阻碍大,所以迁移速度慢,根据分子量大小不同,蛋白质在电泳过程中就会被别离,因此.可以用于测定蛋白质的分子量。当蛋白质的分子量处于?之间时,迁移率与分子量的对数线性相关,符合下式:一/式中:物一蛋白质的分子量;嬲一相对迁移率:卅率;酪一距。待测样品假设与标准蛋白在一样的环境条

45、件下电泳,使用标准蛋白质的迁移率与分子量的对数绘制出标准曲线,依照未知样品的迁移率查标准曲线,就可计算出其分子量大小。该方法目前已经普遍地用来测定蛋白质的分子量。它的优点是具有较好的重复性和准确性,测定样品量少,简便快捷。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳也叫做原生天然状态生物大分子聚丙烯酰胺凝胶电泳【】,蛋白质的别离与其所带的分子大小及电荷有关。中不加入、疏基乙醇等变性剂,别离后能够保持蛋白质的活性,常用来鉴定和提纯同工酶。.别离蛋白质是根据蛋白质分子的电荷性质、电荷多少、分子的大小进行实验,虽然分辨率不太高,但使用此方法进行电泳后蛋白质不会失去活性,?陕西科技大学硕士学位论文实验中蛋白质的自身空间结

46、构与形状、生物活性及蛋白质亚基间的功能与作用均能够较好地留存,从而最大程度的获取活性蛋白,有助于我们综合分析检测蛋白质】,更加深入地探索研究蛋白质的分子结构与各种功能。.别离的是完整的蛋白质单体、二聚体或多聚体,而变性聚丙烯酰胺凝胶电泳别离得到的是变性的蛋白质亚基。.的条件一般需要摸索,电泳前样品的处理对电泳成功率起很大作用,首先要知道蛋白质分子大小,再确定胶的配制浓度,其胶浓度一般低于变性电泳,非变性电泳主要是靠蛋白质在电泳液中自身所带的电荷,而且自身所带较小电荷量,因此电泳缓冲液的值一般调至左右即可。.中,碱性蛋白质与酸性蛋白质的别离方法不同,一般在微酸性条件下别离碱性蛋白质,电泳时需要颠

47、倒阳极与阴极。为了留存蛋白质的活性,防止电泳时产生过高的热量导致蛋白质变性,电泳过程中电流不能太大,一般不超过,并且通常操作需要在低温.。的条件下进行,同时也可以降低蛋白质的水解作用。与.方法相比拟,.最大化地降低了蛋白质发生变性的机率。.主要研究内容和技术路线.课题主要研究内容本课题采用牛乳和关中奶山羊乳作为原料,从宏观到微观,分别对牛乳和羊乳的总蛋白含量、种类、酶活力、各蛋白组分进行了比拟研究,并且建立了可以高效准确地检胶电泳法。采用凯氏定氮法、双缩脲比色法、考马斯亮蓝法三种方法测定牛乳和羊乳蛋白质含量,比拟各种方法的优缺点:采用磷酸苯二钠法测定牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳碱性磷酸酶活力

48、,比色法测定牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳过氧化物酶活力,比拟牛乳和羊乳蛋白含量和乳酶活力的差异。采用等电点沉淀法别离制备牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳酪蛋白,凝乳酶别离制备鲜牛乳和羊乳酪蛋白,采用微滤、超滤、冻干等方法制备牛乳和羊乳乳清蛋白,三氯乙酸沉淀法制备巴杀乳及复原乳中的乳清蛋白。采用离心、乙醚浸提等方法分离制备新鲜牛乳和羊乳脂肪球膜蛋白。采用.方法分析检测牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳别离制备出的酪蛋白、乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白,比拟牛乳和羊乳全蛋白及各蛋白组分的差异,采用非变性电泳方法比拟牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳、乳清.和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法.:。.研究总体设计思路牛乳

49、和羊乳蛋白质差异比拟及检测方法的研究凯氏定氮法、双缩脲乳脂肪球比色法、考马斯亮蓝膜蛋白制法测定蛋白含量备.一鲜牛乳 测定碱性磷酸酶、乳鲜羊乳 过氧化物酶活力法检测血建立.法、,法检测复原乳 翮羊乳中掺入牛乳的研究方法制备酪蛋白、乳清蛋白图.研究方案流程图 一 陕西科技大学硕士学位论文牛乳和羊乳蛋白质总量及乳酶活力的测定.实验内容和技术路线本章实验首先选取新鲜牛乳和羊乳,采用凯氏定氮法、双缩脲比色法及考马斯亮蓝法三种方法测定乳中总蛋白含量,比拟牛乳和羊乳总蛋白含量的差异,并且比拟三种蛋白质测定方法的优缺点。接下来选择两种乳酶,分别用磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶巴氏杀菌指示酶活力,比色法测定乳过氧化

50、物酶抗茵活性酶活力,比拟牛乳和羊乳鲜乳、巴杀乳、复原乳两种酶活力的差异,具体的技术路线如下图。巴杀乳 鲜牛乳复原乳 鲜羊乳型堕适碱性磷酸酶乳过氧化物酶.引言目前我国测定乳与乳制品中蛋白质含量的国标方法即凯氏定氮法,该方法还用来测定蛋白氮与非蛋白氮的含量。凯氏定氮法最先由于世纪提出,可用来测定全部动、植物食品的蛋白质含量,沿用至今已有百余年,是目前国内外测定蛋白质含量的通用方法。该方法的原理是在硫酸铜作用下乳中的含氮有机物与强酸浓硫酸通过凯氏烧瓶加热消化,含氮有机物反响后放出氨气,氨与硫酸反响形成硫酸铵。加氢氧化钠蒸馏释放氨,用硼酸溶液接收氨气,再用标准酸溶液滴定求出总氮量,最后换算出蛋白质含量。.蒸汽发生器.反响室.水蒸气排气孔.实验材料新鲜羊乳:取自西安市北郊夏家堡某农户家。.卫坞:%浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠