功能微生物的筛选和育种

1、矯京师细人学微生物实验论文Formal功能微生物的筛选和选育本科生：朱金风指导教师：戴亦军培养单位：教师教育学院学科专业：生物师范完成时间2011年12月4日功能微生物的筛选和选育摘要：微生物种类繁多，且生长快速，它不仅在生态环境、工农业生 产中有重要作用，而且与人类健康密切相关。许多种类为人类开发利 用，造福社会。正因为它在各方各面都有着其巨大的影响，则要求我 们更好地掌握功能微生物的筛选和育种，所以我们对功能微生物进行 了实验研究，以产淀粉酶细菌为例，在实验过程中我们做了培养基的 配置和灭菌、产淀粉酶细菌的分离筛选和纯化、研究了不同条件对产 淀粉酶细菌产酶的影响、学习了产淀粉酶细菌的鉴定和

2、它的紫外诱变 育种方法。通过实验我们掌握了试管培养基的分装、包扎，纱线的系 法，了解了高压蒸汽灭菌的方法和原理，液体摇瓶培养技术，斜面接 种技术和倒平板技术以及平板划线分离技术，还进一步掌握了稀释涂 布分离菌种技术，学习了 PCR的操作技术，琼脂凝胶电泳法。我们 完整地开展了一次应用微生物课题研究的实训。不仅掌握了相关实验 技术和方法还更好的掌握了如何应用这些技术去解决科学实验和生 产实践中的具体问题，培养了学生的创新思维和动手能力。关键词：功能微生物；产淀粉酚细菌；紫外诱变育种；高压蒸汽灭菌; 液体摇瓶培养技术；PCR的操作技术；琼脂凝胶电泳法。1、材料和方法1.1实验材料及培养基1.1.1

3、实验材料其它：pH试纸，牛角匙，废旧报纸，试管塞，三角瓶塞，棉花， 纱布，纱绳，记号笔，酒精灯，火柴，吸耳球，无菌吸管，无菌离心管，微量移液枪，枪头，PCR管，接种环，20 W紫外灯；仪器：移液管，高压蒸汽灭菌锅，电子台秤，普通天平，摇床，分光光度计，光学显微镜，凝胶电泳仪，水平电泳槽，紫外检测灯，PCR仪、磁力搅拌器、离心机;玻璃器皿:玻璃平1IIL,玻璃试管，玻璃三角瓶，玻璃烧杯，玻璃量筒，分装漏斗，玻璃棒，玻璃涂棒，载玻片;药品：配制牛肉膏蛋白豚培养基，摇瓶发酵培养基相关的化学药 品，试剂与原料，lmol/L的NaOH和HC1,新鲜土壤样品（同学 自备），稀碘液，2%淀粉溶液，乙酸溶液，

4、无菌水三角瓶，带有 玻璃珠装有20niL菌种：各组分离获得的产淀粉酶细菌1株（无 菌水），革兰氏染色全套试剂，Taq酶，反应缓冲液，dNTP, 16S rRNA基因上下游引物，模板（菌落） （PCR反应试剂），琼脂 糖，澳化乙锭，TAE电泳缓冲液，每组分离并鉴定的菌种。1.12培养基培养基：淀粉培养基，无菌培养皿，前一步制备的各种摇瓶发酵 培养基，产淀粉酶的待检菌的平板菌落（提前24小时划线接种）, 肉膏蛋白豚固体培养基。1.2实验方法121培养基的配制和实验材料的准备与灭菌1.21.1淀粉培养基的配制（第一排负责）配方（g/L）：牛肉膏3,蛋白腺10, NaCl 5,可溶性淀粉2,琼脂20,

5、pH7.07.2o（注：配制3000111L,分装于250mL三角瓶，每瓶200mL。）（第二排负责）配方（g/L）：牛肉膏3,蛋白腺10, NaCl5,可溶性淀粉2,琼脂20, pH7.0-7.2o （注：分装20支固体斜面试管（不超过试管高度的1/2）和20支液体试管（不超过试管高度的1/3）不超过试管高度的1/2不超过试管高度的（第三排负责） 不同pH值（每种每组1瓶，每瓶10mL） 配制 1 （g/L）：淀粉 3,蛋白豚 10, NaC15,pH4.0配制 2 （g/L）：淀粉 3,蛋白腺 10, NaCl 5,pH 7.2（第四排负责）不同碳源（每种每组1瓶，每瓶10mL）配制 3

6、(g/L)：淀粉 3,蛋白腺 10, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 1.5,去离子水 lOOOinL, pH 7.2配制 4 (g/L)：葡萄糖 3,蛋白豚 10, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 15去离子水 lOOOinL, pH 7.2（第五排负责） 不同氮源（每种每组1瓶，每瓶10mL） 配制 5 (g/L)：硝酸钠 10,淀粉 3, K2HPO4 1.5, MgSO4*7H2O 1.5, 去离子水 lOOOinL, pH 7.2配制 6（g/L）：硫酸镀 10,淀粉 3, K2HPO4 1.5, MgSO4 7H2O 1.5, 去离子水lOOOmL, p

7、H 7.21.21.2无菌水的准备（第六排负责）501111三角瓶内盛入18ml蒸僧水，放入810颗玻璃小珠，加盖瓶塞, 包扎待灭菌；每2人准备一瓶；50nil三角瓶内盛入18-201111蒸憎水，加盖瓶塞，包扎待灭菌；每4人准备一瓶。1.21.3灭菌材料与器皿的包扎 1）试管的包扎：7支试管为一包扎单位，用报纸将试管塞部分包扎2）三角瓶的包扎：用报纸将瓶塞部分包扎严密，以纱线系之；3）培养皿的包扎：6个平皿为一包扎单位，用报纸以滚筒方式将其包紧；每2人扎一包；4）1.5mL离心管的包扎：6个离心管为包扎单位，用报纸包成小包。每人扎一包。B手灭菌俗1.2.1.4高压蒸汽灭菌过程：加热锅体夹层中

8、的水至沸腾，当饱和 蒸汽压达到lkg/cm2的时候，锅内温度即可 达到121°C,在该温度下维持20-30 nuii即可 杀死包括细菌芽砲在内的所有微生物，达到 彻底灭菌Z目的（灭菌釜内的空气是否排尽将直接影响到锅体内物品的灭菌效果）。（对1.2.1.3中的试管，三角瓶，培养皿，玻璃器皿，离心管进行高 压蒸汽灭菌。）1.2 2产胞外淀粉酶细菌的分离和筛选1.2.2.1制备土壤稀释液称取土壤2g,放入18mL带有玻璃珠的无菌水三角瓶中，振荡5min（稀释度已为10-1）,然后在离心管屮依次稀释至103、10-4稀释度。1.2.2.2制备淀粉培养基平板每组制5块淀粉牛膏蛋豚培养基平板：微

9、波炉加热融化淀粉培养基， 冷却至不烫手的温度，倒入灭菌的空培养1IIL中（20ml左右），并轻轻摇 晃混匀，冷却。1.2 2.3稀释涂布无菌操作法分别吸取103、104上壤稀释液0.lniL,加在淀粉平板 培养基上（每个稀释度一块）。用无菌玻璃涂棒均匀涂布，静置5mm 后，置于恒温培养箱中培养。1224划线分离用接种环挑取一环10-1丄壤稀释液，在一块淀粉培养基上进行划线 分离。倒置于恒温箱培养。S V-4划线分离示意图1.2.2.5观察水解圈和测量H/C值 24小时后（第二天天下午），在之前稀释涂布和划线的3块淀粉 培养基上选取典型细菌菌落（尽量选取边缘整齐和规则的菌落）, 并用记号笔进行编

10、号。将编号后的菌落用无菌牙签挑取，在备用的1块淀粉培养基平板大小（C）和水解圈大小（H） o找到水解圈最大的12个菌落和编号，在对应编号的点种平板上做好标记。将点种平板继续置于30°C培养。1.2.3不同营养和培养条件对淀粉酶产生菌生长的影响 123.1发酵液接种提前24h将平板菌种用接种环挑取，在液体试管中打散混匀，然后按0.5%接种量分别转接如卜六种液体摇瓶发酵培养基。（pH 4.0; pH 7.2;碳源淀粉；碳源葡萄糖；氮源硝酸钠；氮源硫酸镀） 1.2.3.2菌种保藏挑取平板菌落，在斜面试管培养棊上划线，30°C培养，然后置冰箱低 温保藏。1233菌体生长量的测定1）

11、将培养24h后液体摇瓶培养物分别取出2inL于试管中，加入8inL 蒸慵水，进行5倍稀释。2）将各稀释液分別倒入比色杯中，在721型分光光度计600iun波长 下测定吸光值（OD600值）。3）如果菌液浓度过大，可继续稀释后再进行测量，保证OD600值应 控制在0.11之间。4）分别记录各种不同培养基和不同培养条件下OD600值大小，评价 对菌体生长量的影响。摇匀后40°C恒温水浴保温5minns蒸憎水02mL0.2mL1.2.3.4不同条件对淀粉酶活性的影响测定加入试剂测定管空白管1 %的淀粉溶液O.lmLO.lmL缓冲液O.lmLO.lmL摇匀后40°C保温15min乙

12、酸溶液0.5mL0.5mLOOOrpm 离心 5min取上清加入lm席碘液试管中加蒸憎水稀释至10mL124产淀粉酶菌种的鉴定1.2.4.1产淀粉酶待检菌的培养特征与形态特征的观察与鉴定a.培养特征的观察:菌落形状与人小，边缘,表面，隆起形状，透明度，菌落与培养基颜色等;b. 细菌细胞的显微观察：细胞形状是杆状（长杆或短杆）还是球状?有无芽孑包？有无荚月莫?c. 细菌的革兰氏染色：按照书上操作方法进行（设立标准的革兰氏 阳性和阴性菌为对照）。G+G-G+和G的混合1.2.4.2细菌的16S rRNA分子鉴定用灭菌枪头挑取单菌落边缘少许菌体，刮蹭于PCR管壁底部少许。反应体系：在一个PCR管中用

13、微量移液枪加入下列物质的混合液24.5U1,置于冰上备用。Taqbuffer (10X )2.5 ulMgC12 (25mM)1 U1dNTP (2.5111M)2.5 nlPiiiner Forward (50 inM)1 HiPiiiner Reverse (50 111M)1 u 116.5 ulddH2O振荡，将菌体和反应体系充分混匀最后加入：rTaq （2U/iil）0.5111PCR反应条件：95°C预变性5】nin后,95°C变性lmin,59°C退火lmin，72°C延伸2min,共25个循环,72°C延伸lOmin。1.2.4

14、.3琼脂糖凝胶电泳1）制胶：配制0.7%琼脂糖溶液20111L,用1 XTAE电泳缓冲液做溶 剂，加热溶解，稍冷后，加入模具中，插入梳子，待胶凝固。2）制样：PCR反应结朿后，取出PCR管，用微量移液枪吸取5ul与 liil 6 Xloading Buffer混合后全部点入浸于TAE电泳缓冲液中的琼 脂糖凝胶的样品孔中。琼脂糖凝胶电泳装置3）电泳：100V电泳20分钟。4）染色：将凝胶置于样品染料漠化乙锭屮染色；10mm,然后将凝胶置于紫外灯下进行检测，当在凝胶上出现预期大小的DNA条带（约1.5Kb）,则认为是PCR阳性，这时将与此电泳样品对应的PCR反应管放置冰箱短期保存。1.2.5淀粉酶

15、产生菌的紫外诱变育种1251紫外线对细菌的诱变效应a. 细菌悬液制备:取液体培养物（各组提前24小时，将之前保藏的试管斜面菌种转接液体摇瓶过夜培养o） lniL于doif管屮，每 组3管，80001pm,离心5nun,弃上清；菌体用无菌水洗涤离心 一次，最后每个doif管各加1.5111L无菌水制成均匀的菌悬液。b. 平板制作：融化淀粉培养基，每组倒4块平板，在平板上做好标 识。c. 紫外线处理：将紫外灯打开预热20分钟；取6cm无菌平皿一个,加入2管菌悬液，共3ml；将上述平皿置于紫外灯下的脱色摇床上，打开IIIL盖，距离紫外灯管30cm,照射3mm （单号排）或者6niiii （双号排），

16、盖上皿盖。d. 稀释菌液：在超净台内，将照射后的菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释成10-1-10-5 （在dorf管中进行）。e. 涂布平板：取10-3. 10-4 （单号组）和10-4. 10-5 （双号组）两个稀释度的菌悬液各O.lnil涂布均匀。以同样的操作，取未经紫外线处理的菌悬液稀释涂布平板作为对照。1.2.5.2培养与观察及结果判断1）涂布好的平板置于瓷盘中，盖上盖子，置于30°C避光倒置培养48 小时。2）计数：将培养好的平板取出进行细菌菌落计数；根据对照板上的 CFU（colony foniiiiig xuiit）数计算出每毫升 菌悬液中的CFU数， 同样计算出紫

17、外线处理后的CFU数。3）存活率（）=（处理后每毫升CFU数/对照每毫升CFU数）X1004）致死率（）=（对照每毫升CFU数-处理后每毫升CFU数）/ 对照每毫升CFU数X1005）观察诱变效应：测量淀粉水解圈直径与菌落直径并计算其比值（HC比值），和对照板相比较，说明诱变效应。2实验记录与结果2.1平板划线分离结果图7-29枯草芽胞杆茴在血琼脂平板上的 筒落特征（182肋）22观察水解圈测量H/C值透明圈（H）与菌落直径（C）比值的人小在一定程度上反映了菌株产生淀粉酶的能力：H/C值越大，表明分泌的淀粉酶越多，水解淀粉的能力也就越强。试管号12345678水解圈直径（H）mm3.22.61

18、.82.92.42.03.12.2菌落直径（C）min1.20.70.50.90.70.51.00.6H/C值2. 673.713.603. 223434.003. 103. 672.30D600值计算试管号123456OD600<a0. 7270. 8950. 7950. 0870.7190. 4832.4淀粉酶酶活显色后，立即于660nm波长测定其吸光度（A）。计算各样品吸光度大小酶活力。即以ImL粗酶液在40°C, pH6.0条件下15min所分解O.lmg的淀粉质量为1个酹活力单位。离心管号1234560空白管）吸光度（A）1.0311.1161. 1340. 3210

19、. 7410. 6181.187淀粉酶活性6. 5712. 9912. 23336. 47918. 78723. 968A空白管一A测定管A空白管0.2150.125革兰氏染色结果G+G-26琼脂凝胶电泳结果第二条2/7常用的各类诱变剂物理诱变剂紫外线、快中子、诲 1线、卩刻线、Y射线、激光、高子朿化学诱变剂或星类似物2氨星碟吟、5漠尿啣;8氮叫碟 岭与减基反应的物质硫腹二乙酯、甲基磕巖乙酯、亚硝基WL 亚硝基甲基JK、亚硝基乙基腺、亚硝嚴、 氮芥、四乙烯亚胺、務胺IEDNA分子中插入 或徐失一个或几个或 基叶唳类染料生物诱变剂噬菌体、转座子2.8经紫外照射后的细菌存活率和致死率。紫外线照射处

20、理结果稀释度10'310=4菌落数2183、讨论3.1培养基配好后为什么要立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无 菌的？答：原因：培养菌配好后当天装袋、当天灭菌，如果存放时间长不进 行灭菌培养料内的微生物就会在料内发酵生长，从而破坏培养基内的 营养成分，并且由于这些微生物的生长过程中分分泌一种或多种毒素 从而抑制好菌的生长。检査无菌的方法:就是将已经灭完菌的菌棒放到25 28°C的恒温环境中避光培养3天后，拿出来检查看袋内有没有杂菌滋生的痕迹。看 菌袋内有没没有导演变色、出现斑点等情况的发生，如果有就证明灭 菌不彻底。3.2高压蒸汽灭菌应注意哪些事项？答：空气外排要彻底，灭菌釜

21、内的空气是否排尽将直接影响到锅体内 物品的灭菌效果；不要让培养基倾斜以防溢出；灭菌物品Z间不要摆 放太挤，以保证高压蒸汽灭菌能够彻底，3.3双酶水解法的过程是什么？答：双酶水解法：a -淀粉酶糖化酶淀粉糊精、低聚糖葡萄糖，麦芽糖液化糖化34温度为何设定为40-C? 答：原因：因为40°C是产淀粉酶菌的最适温度。3.5淀粉酶活测定还有哪些方法？答：方法：初始速率法；DNS比色法。3.6 (DNA)琼脂糖凝胶电泳原理是什么？有哪些影响因素？答：原理：带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极泳动 的现象。在本实验中，DNA分子带负电荷，向正极泳动。影响泳动率的因素：电荷效应和分了筛效应(R卩DNA分了本身的人 小和构型)。在本实验中，分子量越小，泳动越快。37紫外线诱变的机制是什么？答：机制：DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的喘唏， 它比瞟吟更为敏感。紫外线引起