SMRT技术于微生物全长16SrRNA测序应用

1、smrt技术于微生物全长16s rrna测序应用16s rrna基因是原核牛物所特有的基因，并h在原核牛物中具有极高的拷 贝数。全长1 542 nt的dna序列包含9个间隔的高变区，兼具特异性和保守性 的16s rrna基因序列作为微生物标记被广泛应用于研究屮。相比dna探针、变 性梯度凝胶电泳和sanger测序等方法，高通量测序技术在16s rrna基因序列研 究中体现出极大的优势。以roche, illumina等为代表的第二代测序技术将16s rrna基因测序的通量大幅提高，为研究者提供对特定环境微牛物进行全面分析 的可能。冃前，第二代测序技术已经成为环境微生物研究的主流手段。但是，第

2、二代测序技术在16s rr7a基因测序屮存在的缺陷也不可忽视一一测序片段短。 第二代测序平台中，测序片段最长的是roche公司开发的454 gs flx+测序仪， 其测序片段长度仅为700 bp0过短的测序片段使得研究人员在微生物16s rrna 基因测序屮，只能选择部分高变区进行研究，这对研究结果的准确性有较人影响。目前pacbio测序仪的测序长度可达到20 000 bp,这为基于16s rrna基因 测序的微生物研究提供更好的选择。本文将为大家总结pacbio的smrt测序技术 在全长16s rrna的成功应用，最后提岀目前存在的问题和可能的解决方案，以 期为研究人员采用smrt测序技术研

3、究微生物16s rrna基因提供参考。利用pacbio全长16s扩增子测序评估婴儿配方食品安全性 研究方法对30个婴儿奶粉样品（12份国产，18份进口）进行pacbio全长16s扩增 子测序，测序平台:pacbio rs ii,试剂：p6c4。结果分析1, 微生物多样性及相对丰度分析1相对丰廣分俯本硏究共親*145.057录16s rrnalqff列 童定出25个细茁门322个588个细困种 興中优为葬炳療朗的场丼as(streptococcus then»ophilu5» 20.59x),(lactococcus lactic 19.18x)>loctococcus

4、 pisciuv <16.04x) “种”水平的微生物多样性分析及相对丰度（相对丰度1%）2, 国产和进口奶粉的优势菌株存在差异mrouppcnqlp «0species levelotnr species adnwobmfer teumannfi pwudomwfngi saxusg/emis bkiuus ma ljsinibkus hsihrnk bdo6«a/shem«ca$aioxyt>jdtes aiwthenws umbxjhilbwcmliccdcoccvs rncgcusznm/tmdtus ne$unbolwi$fiiofi/sct

5、reas bdococuts pisciumuctococcirs toctrssnptocoa” thtrmophrfuswww 歼m&wwwzwggqdky a_八八>fmiol 012ibdin ifi 口 2群进口 3 屏sq4ci国产配方奶粉以lac tococcuspiscium（21. 78%）和 lactococcus lactisl. 16%）为主。 分析进口婴儿配方奶粉的优势菌株，1 群以 strep tococcusthcrmoph 17us（65. 55%）为主， 4 群以 lactococcus pisciui畑.04%）为主，2 群和 3 群以 str

6、eptococcus thermoph i lus lac tococcus 1 act is 和 lactococcus piscium为主。30个样本“种”水平的微生物丰度3,预热处理和杆菌相对含量之间的关系通过乳清蛋白氮指数(whey protein nitrogen index, wpni)可检测乳品中乳 清蛋白的变性度，反应乳品的热处理程度。本研究将样品微生物群落"属水平上 的相对丰度结合wpni进行分析，结果表明，预热处理的温度与芽砲杆属(bacillus sp.)丰度负相关，与链球菌属(streptococcus sp.)和乳酸菌属(lactobacillus sp.)

7、 正相关。利用pacbio全长16s扩增子测序于健康奶牛与乳房炎奶牛肠道菌群定量与宏基因组研究牛场管理、病原菌感染和奶牛体质等因素都可能造成奶牛乳房炎(体温升高, 乳房红肿痛，体细胞数(scc)升高，牛乳呈棕黄色，味浆)，导致巨额经济损 失、增加细菌耐药性、抗性基因污染，最终威胁食品安全。因此对益生乳酸菌在 奶牛养殖中应用研究具有重要意义 研究方法选取健康组(ch, 20 头，scc< 30 万/ml),乳房炎组(cm, 20 头,=,h, scc=,n>100 万/ml),采用二代、三代测序技术相结合的方法从宏基因组角度完成了 40头奶 牛粪便屮微生物多样性和metagenome

8、分析，探究揭示乳腺炎与奶牛肠道微生物 及功能基因的关系。结果基于三代测序技术完成健康组、乳房炎患病组共40头奶牛肠道微牛物组成 分析，共识别出319个细菌种，平均相对含量在0.1%以上的菌种共有28个。其 屮蝙蝠弧菌属vampirovibrio在乳房炎组含量高，该菌可引起轻度腹泻与红细胞 溶血。真杆菌展eubacterium,颤螺旋菌® oscillibacter等产酸菌在健康组含量较 高。a多样性分析结果与mann-whitney检验发现，健康组微生物物种丰度和多 样性显著高于乳房炎组，乳房炎组奶牛肠道微牛物结构趋于简单化。利用pacbio全长16s扩增子测序以评估苜蓿青贮的质量苜

9、蓿是畜牧业中重要的饲料作物，它包含很多牲畜生长所需的物质，如蛋白 质、维生素和矿物质等，冃前保存的方法就是青贮法，在贮藏时一般会加入乳酸 菌促进发酵过程。随着smrt技术长读长优势显现，研究者通过smrt测序对四个 样木添加产乳酸菌发酵前后的微生物菌落进行了研究。实验方法四种以乳酸菌为基础的添加剂处理苜蓿青贮；发酵过程中，添加剂有利于降 低p11值和霉菌毒素，而增加有机酸；smrt分析8个发酵后样本，细菌种类和丰 度显著上升；在原料中，巨大芽砲杆菌是起始优势物种，经过发酵后，添加剂中 存在的乳酸片球菌和植物乳杆菌成为优势物种。研究结果1，所有样本屮共鉴定到960种细菌，其中12种细菌含量均大于

10、1%；2, 发酵前后物种数和相对丰度变化很大；3, 发酵后饲料中的微生物组成与所添加的菌群有很大关系，基于l'nifrac 的pcoa分析显示发酵前和发酵后的样本组成差异很大。species levleo(次ifoimpunqvuaisto:发酵前后的微生物菌落比较enterobacter cloacae bacillus megaterium lactobacillus pobuzihii lactobacillus plantarum pediococcus acidilactici unidentified salmonella enterica bacillus marisfl

11、avi pantoea agglomerans ochrobactrum lupin!we is sell a cibaria enterococcus durans bacillus cereus other species以上各项成果均提及到一项技术服务-pacbi。测序应用于微生物群落分析， 那么，pacbio smrt测序在微生物群落分析中的优势有哪些？pacbio平台测序产牛phylotags的过程中不需要扩增，相较于其他测序平 台降低了测序平台的特异性偏差；pacbio平台测序产生的phylotags具有超高的一致准确性，并且能够真实 反映微生物的高gc/低gc区，不会产生扩增偏好

12、性。pacbio公司正在努力改进提高测序正确率，目前的p6-c4试剂的平均正确 率可达86%以上，读长可达12kbo随着时间的推移，使用pacbio测序的16s指 标将逐渐达到sanger扩增子的水平。关于tbc天津生物芯片三代测序平台自2013年运行至今，作为国内比较早一批提供 三代测序服务的机构，现已形成以pacbio单分子测序rsii和sequel “双核” 平台为中心，现已成功利用三代测序技术完成细菌、真菌、昆虫、动植物、人类 等数百个物种的基因组、全长转录组测序及分析工作，并开发建立了基于三代测 序技术的靶向测序、宏基因组测序、表观遗传测序、以及单细胞测序系列方 案。2003年至今，

13、累计为客户在国际权威期刊发表sci论文178篇，其中包 括: na/ture、nature communication、pnas、fems microbiol rev plos geneticso欢迎致或发邮件tjbiochipmk126 com进行咨询tbc 16s 全长测序服务!参考文献1. y. zheng, etal., using pacbio long-read high-throughput microbial gene amplicon sequencingto evaluate infant formula safety. j agric food chem (2016)2, weichen , e