第18章正粘病毒科(Orthomyxoviridae)

1、第十八章 正粘病毒科(Orthomyxoviridae)一、 概述主要参考文献一、 概 述流行性感冒病毒(以下简称流感病毒)的血凝素和神经氨酸酶对粘(糖)蛋白有亲和力，因此，原称为粘病毒，后统称为正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，以与另一科病毒-副粘病毒相区别。甲型流感病毒的感染范围很广，常以流行的形式出现，发病急剧，蔓延迅速，危害很大。在1918年第一次世界大战结束时，流感大流行，席卷全世界，死于流感的人比战争本身死亡的还多。1933年，Smith等自人体分离出了甲型流感病毒。家畜和家禽的流感都是流感病毒引起的。Shope于1931年研究猪的流感，从猪体分离出一株病毒，将此种病

2、毒接种易感猪后，使其发生了典型的猪流感。Sovinova和Waddell等先后从马体中分离出马甲1型和马甲2型两株马流感病毒。1955年证明鸡流感病毒含有甲型流感病毒核蛋白。乙型流感病毒发现于1940年，能引起人的呼吸道感染，但流行规模比甲型流感病毒小得多。丙型流感病毒也是感染人的病毒，但极少引起流行。1982年郭元吉等发现了猪的丙型流感病毒。1.分类现状与命名正粘病毒科中原来只有一个属，即流感病毒属。根据国际病毒分类委员会(ICTV) 第6次分类报告(1995)将正粘病毒科由原来的一个流感病毒属分为三个病毒属：甲、乙型流感病毒属(Influenza virus A, B)；丙型流感病毒属(I

3、nfluenza Virus C)；“类托高土病毒属”(“Thogotolike viruses”)。三个属的代表种分别为甲型流感病毒、丙型流感病毒、托高土病毒(Thogoto virus)。现将正粘病毒科的分类现状列表18-1。表18-1. 正粘病毒科分类现状科 属 代表种 成 员正粘病毒科（orthomyxoviridae）甲、乙型流感病毒属(Influenza virus A, B) 甲型流感病毒(Influenza virus A) 丙型流感病毒属(Influenza Virus C) 丙型流感病毒(Influenza Virus C) “类托高土病毒属”(“Thogoto-like

4、virus”)托高土病毒(Thogoto virus) 有关流感病毒的分类与命名，世界卫生组织1971年推荐首先以病毒蛋白为依据，将其分为甲、乙、丙三型，再按表面抗原区分为血凝素(H)和神经氨酸酶(N)的不同亚型。迄今已发现17种H亚型，包括人的H亚型4种(H0，H1，H2，H3)、马的H亚型2种(Heq1,Heq2)、猪的H亚型1种(Hsw1)和禽的H亚型10种(Hav110)；N亚型有10种，包括人的N 亚型2种(N1，N2)、马的N亚型2种(Neq1,Neq2)和禽的N亚型6种(Nav16)。但在1980年，WHO专家小组又提出了甲型流感病毒新的分类和命名方法，将H分为16个亚型，N分为

5、9个亚型，取消了过去使用的马(eq)、猪(sw)和禽(av)等抗原亚型符号，现将两种分类命名法对比列表18-2如下。表18-2. 甲型流感病毒H和N亚型新旧命名法比较H亚型N亚型1980年命名H1 H2H3H4 H5H6H7H8H9H10H11H12H13H14H15H161971年命名H0，H1，Hsw1H2H3，Heq2,Hav7Hav4Hav5Hav6Heq1,Hav1Hav8Hav9Hav2Hav3Hav10Hav111980年命名N1N2N3N4N5N6N7N8N91971年命名N1N2Nav2,Nav3Nav4Nav5Nav1Neq1Neq2Nav6按照新的亚型命名方法、猪型、甲0

6、型、甲1型和新甲1型都属同一亚型，即H1N1亚型，这样似乎体现不了我国甲型流感病毒的抗原性变异情况，因此本章有一些叙述中仍沿用我国对家畜流感病毒的习惯亚型名称，继续称为猪型、马甲1、马甲2型以及人的甲0、甲1、甲3和新甲1亚型等。根据1980年世界卫生组织公布的流感病毒命名方法，一株流感病毒名称中包括下面几项内容：型别/宿主/分离地点/毒株序号/分离年代(亚型)。如A/duck/Ireland/113/83(H5N8)，这是一株分离自鸭的甲型流感病毒，分离地点为爱尔兰，毒株序号为113，分离时间为1983年，亚型为H5N8。应说明的一点是，对从人分离的流感病毒，命名时可省略宿主项。如A/京科/

7、1/56(H1N1)，A/Hong Kong/2/68(H3N2)。2. 形态结构与化学组成典型的病毒粒子呈球状，直径80120nm，平均为100nm。某些毒株，特别是在初次分离时，常呈丝状，丝状体长短不一，长者可达数微米。流感病毒的多形性，在动物病毒中是比较突出的。但是，不论长丝状或球形病毒粒子，其直径都相似。正粘病毒与副粘病毒有相似的特性，但又有区别，详细内容如表18-2。表18-1. 正粘病毒科与副粘病毒科的区别特 性 正粘病毒 副粘病毒病毒粒子大小 80120nm 125250nm RNA 合成部位 胞核 胞浆基因组组成 分节段 不分节段转录需要引物 是 否附属核衣壳蛋白种类 3 2

8、囊膜与细胞融合的部位 细胞内 细胞表面基因重组的频率 高 无进化率 高 低病毒粒子从细胞膜芽生时获得病毒囊膜，囊膜内含有宿主细胞膜脂质，但缺乏宿主细胞的蛋白质。有两种不同型的囊膜纤突致密地镶嵌成规则的毛边样，一种是血凝素(H或HA)， 是棒状的糖蛋白多聚体；另一种是神经氨酸酶(N或NA)，呈蘑菇状，亦为糖蛋白多聚体，但与某些正常细胞中神经氨酸酶完全不同。据统计，1个直径100nm的病毒粒子，平均约有500个纤突，包括HA和NA。其中HA约占90%，NA只占10%左右。图18-1禽流感病毒磷钨酸负染电子显微镜照片-自李成等图18-2 马流感病毒(横杠=100nm) 自贾补年注意杆状和椭圆形等不同

9、形态流感病毒(甲、乙型)的单链RNA由8个节段组成，丙型流感病毒仅7个RNA节段，一个RNA节段代表一个基因，这些节段以与核蛋白和转录酶结合的形式存在。流感病毒由68%70%的蛋白质、1%2%的核糖核酸(RNA)、20%25%脂质和5%8%的糖组成。病毒蛋白质含有5种多肽，即血凝素、神经氨酸酶、基质蛋白、核蛋白和多聚酶。3理化特性HA的存在使病毒能吸附在许多哺乳动物和禽类红细胞表面的糖蛋白受体上。这种结合在4条件下相当稳定；但在37时，由于NA对受体的破坏作用，使病毒迅速从红细胞上释放出来。流感病毒与其它螺旋样对称的有囊膜病毒一样，对干燥、冻融、脂溶剂的灭活作用极为敏感。二、正粘病毒基因组结构

10、与功能甲、乙型流感病毒的基因组是由8个分节段的单链、负股RNA组成，其中4、6号两个节段编码病毒囊膜糖蛋白。而丙型流感病毒仅编码单一表面糖蛋白，因而丙型流感病毒的基因组由7个RNA节段组成。流感病毒基因组节段具有共同的特点：所有的RNA节段均具有相同的5端，它由13个核苷酸所组成；3端由12个高度保守的核苷酸组成，靠近3端的第四个碱基，有些毒株为U，有的为C。在这些共同序列中，有部分序列可反向互补，这一点对病毒RNA的复制很重要；在每一节段靠近5端1521核苷酸处有一保守区，其序列为poly(U)。这一保守区在病毒 mRNA合成时是产生poly（A）的信号。因为每一RNA节段的3和5端有部分序

11、列互补,所以每个RNA节段呈锅柄环状。第16个节段各编码一个病毒蛋白，7、8节段各编码2个病毒蛋白，这样甲、乙型流感病毒具有10种蛋白多肽。理论上，丙型流感病毒应具有9种蛋白多肽，可目前仅证实8种。不同节段基因负责编码不同的蛋白，具体见表18-3。 由于流感病毒的基因组分节段的结构特点，导致了基因组的易变性和具有很高的重组率。流感病毒RNA总分子量为5.9×1066.3×106。甲、乙和丙型流感病毒基因组的大小和碱基组成不尽相同，AUGC的比率甲型为1.25；乙型为1.42；丙型为1.46。提纯的流感病毒RNA不具有感染性，需与一些具有多聚酶活性的蛋白结合在一起才具有感染性

12、。表18-3. 流感病毒RNA节段编码蛋白质片段序号 流感病毒编码蛋白甲流感病毒 乙流感病毒 丙流感病毒1 PB2 PB1 P12 PB1 PB2 P23 PA HA P34 HA HA HE5 NP NP NP6 NA NA，NB 7 M1，M2 M1，M2 M8 NS1,NS2 NS1,NS2 NS1,NS2三、病毒蛋白及其功能1核蛋白(NP)流感病毒的核蛋白，分子量约60kDa，是单体磷酸化的多肽，是构成核衣壳的主要成分。核蛋白具有型特异性，根据其抗原性的不同，可将流感病毒分为甲、乙、丙三型，它是可用补体结合试验方法测定的型特异抗原，即可溶性抗原。它没有感染性，在病毒粒子内部卷曲成螺旋状

13、结构，是病毒核酸外面的一种蛋白质，但它并不把核酸完全包被起来，因而核衣壳仍对核糖核酸酶敏感。核糖核酸被酶裂解后，核蛋白亚单位仍然存在，推测核蛋白自身形成一种内聚结构。核蛋白是一种多功能蛋白质，除了形成病毒的核衣壳外，在病毒基因组的转录和复制中也可能起作用。在确定病毒的宿主特异性方面也有作用 ，例如根据对许多流感病毒NP基因的研究，可将它们分为5个不同的组，所有的禽流感病毒分为两个组，马流感病毒分为两个组，猪流感病毒分在一个组。核蛋白的磷酸化取决于宿主细胞，与病毒感染的宿主谱有关。核蛋白分子至少具有3个独立的抗原位点，借助于单克隆抗体和多克隆抗体进行研究，发现所有被测毒株都有一个共同位点，针对这

14、一位点的单抗可抑制病毒RNA分子的体外转录。针对核蛋白的单克隆抗体不能给动物提供被动保护，用提纯的NP免疫动物，也只能产生很微弱的抗感染能力，但NP是细胞毒性淋巴细胞识别的主要抗原。2基质蛋白(matrix proteins, MA) 基质蛋白是一种非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA节段、丙型流感病毒的6RNA节段编码。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的内侧，也称为内膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。片段7或6有两个读码框架，可转录出两个mRNA，分别翻译出一种蛋白质。因此流感病毒的基质蛋白有两种，即M1和M2。M1由252个氨基酸残基组成，分子量约26kDa，它是病毒的主要结构蛋白，占流感病

15、毒蛋白总量的40%。这种蛋白也具有型特异性， 其抗原性的差异是流感病毒分型的依据之一。M1位于病毒囊膜的类脂双层内侧、核衣壳的外侧，是维持病毒形态的结构蛋白。另外M1还可在感染细胞的细胞核、细胞质和细胞膜上发现。研究表明，M1的氨基端含有一亲水区，羧基端与病毒的转录酶之间相互作用。流感病毒的M1具有多种功能，除维持病毒粒子的形态外，还能调节病毒转录酶的活性，另外在子代病毒粒子装配过程中也起重要作用。据报道，M1单克隆抗体不能给动物提供被动保护。M2由97个氨基酸残基组成，分子量大约为15kDa，由片段7转录的第二个小mRNA翻译出。M2也是一种跨膜蛋白，主要以四聚体形式存在于感染细胞的细胞膜上

16、，另外也是病毒囊膜上的蛋白组分之一。每个病毒粒子大约含有1468个M2分子。流感病毒M2的主要作用是在HA合成过程中作为质子通道控制高尔基体内的pH值；在病毒脱壳时酸化病毒粒子的内部环境；另外在病毒装配过程中也起作用。流感病毒M2的氨基酸序列很保守，在所检测的毒株中，其同源性高达90%。这种蛋白在感染细胞的细胞膜上与I类糖蛋白相似，即氨基端在细胞外，羧基端在细胞内。细胞外部分为1823个氨基酸，19个氨基酸残基组成的疏水区插入细胞膜内，羧基端的54个氨基酸位于细胞质内。氨基端的10个氨基酸非常保守，在所测的禽流感和人流感病毒中，其序列几乎完全相同。研究表明，针对M2氨基端的单克隆抗体可抑制病毒

17、蚀斑的增大，其作用方式与抗神经氨酸酶抗体的作用方式相同。用这种单抗筛选突变株时，不仅引起M2的突变，还能引起M1的突变。3聚合酶(polymerase)流感病毒的聚合酶由三种成分组成，它们是PB1、PB2、PA。这三种蛋白质是病毒粒子中分子量最大的蛋白质，分别为96kDa，87kDa，85kDa。这三种蛋白质在氨基酸序列上有一共同特点，都含有一特异的亲核序列区，其作用是使这几种蛋白质在胞浆合成后能顺利进入细胞核。所以在感染细胞的细胞核内都可发现这三种蛋白成分。流感病毒聚合酶复合体在病毒粒子中所处的位置目前已经清楚。三种蛋白质位于病毒基因组的3末端，免疫电镜技术已直接观察到这一复合体位于每一个核

18、壳体的一端。聚合酶复合体的三种成分分别由不同的基因组片段编码。PB1由片段2编码，共757个氨基酸残基。其功能是在病毒mRNA合成起始后使之逐渐延长；在模板RNA(cRNA)和病毒RNA(vRNA)的合成过程中也靠PB1的作用使合成链增长。PB2由片段1编码，大约759个氨基酸残基。其作用是在病毒mRNA转录的起始阶段，识别并结合在5端I型帽子结构。另外它还具有限制性内切酶活性，参与宿主mRNA帽子结构的切割。PB2在病毒cRNA和vRNA合成过程中的作用还不清楚，因为这些过程不需要宿主mRNA的帽子结构做引物。PA由片段3编码，由716个氨基酸残基组成。在病毒RNA转录和复制过程中，PA与P

19、B1和PB2在一起随链的延长而移动，因此推测PA与PB1和PB2共同构成RNA聚合酶复合体。但PA在病毒RNA合成过程中的作用还不清楚，有人认为可能是一种蛋白激酶或解旋蛋白。4非结构蛋白(nostructural proteins, NP)甲、乙型流感病毒的非结构蛋白由片段8编码，丙型流感病毒由片段7编码。片段8或7也有两个读码框架，可编码两种蛋白质即NS1和NS2，两者的分子量分别为25kDa和12kDa。主要在胞浆内，在病毒粒子内不存在这两种蛋白成分。流感病毒非结构蛋白的功能还没有彻底搞清，可能在病毒复制过程中起一定作用，NS2还可能有调节非结构蛋白合成的作用。在细胞感染流感病毒的早期就可

20、发现细胞核内有大量的NS1聚集，另外还可在细胞浆内发现。NS2合成较晚，主要存在于细胞胞浆，也可在细胞核内发现。序列分析表明，NS1和NS2有70个氨基酸的重叠，并且在氨基端有9个氨基酸是相同的。NS1蛋白含有两个核定位信号区，其中3438位氨基酸残基处的信号区非常保守，在所有甲型流感病毒中都相同。第二个信号区在203237位氨基酸残基处，在大多数甲型流感病毒中都有这一序列。野外分离的禽流感病毒的某些毒株，NS1蛋白的羧基端有氨基酸缺失现象。不同亚型毒株的NS1在带电性和磷酸化方面有很大差异。用多克隆抗血清对NS1的抗原性进行研究，结果发现，不同亚型毒株之间存在明显的交叉反应。从人、猪、马分离

21、的甲型流感病毒，其NS1的抗原性非常相似，一般方法难以区分，而禽流感病毒株的NS1其抗原性有变异。5血凝素 血凝素(HA)是流感病毒的主要表面糖蛋白，具有凝集多种动物红细胞的性质，借助HA对细胞受体的作用，使病毒附着于细胞，在穿膜过程中起关键作用。HA具有诱生中和抗体的能力，产生免疫保护作用。HA可以直接通过血凝反应检测，其抗体可用血凝抑制、中和试验、补反和ELISA方法来检测。流感病毒的HA呈三角细长的棒状构造。HA为75kDa的糖蛋白，可水解成两个独立的肽链,两个多肽由二硫键连接在一起。HA水解成HA1和HA2是感染的先决条件。HA的变异性很强，是病毒发生抗原变异的主要原因。HA由甲、乙型

22、流感病毒RNA片段4编码，是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构域：信号肽(前导序列)、域、跨膜域和胞外域。免疫学和生物化学方法研究证明，HA在细胞内质网合成。合成后由内质网运送到高尔基复合体，最后到达细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰，如将N葡萄糖苷寡糖加到天门冬酰胺残基上，有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。修饰的位置随毒株不同而有区别。这样形成的单体HA分布在内质网膜上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠成一定的形状，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时，还经过几个切割加工过程，包括N端信号肽的切除及

23、HA1和HA2的产生。N端的信号肽约由16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网膜。HA合成后由信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链，产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基，这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为36kDa和27kDa，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其它非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。HA的一级结构: 根据对不同亚型毒株HA的氨基酸序列测定及根据其片段4的核苷酸序列推测，HA大约由562566个氨基酸残基组成。在HA的氨基端有一由16个疏水氨基酸组成的信号肽

24、，在加工过程中被信号肽酶切掉。紧接信号肽的328个氨基酸残基是HA1部分，羧基端的221个氨基酸残基构成HA2。在HA1和HA2之间有一精氨酸残基，在加工过程中被切掉。经过切割后产生的HA1和HA2由一个二硫键和许多非共价键连在一起，两条肽链之间的二硫键在HA1的14位和HA2137位的半胱氨酸之间形成。另外在HA1和HA2分子内还有其它的二硫键。HA2的羧基端(185211氨基酸区域)主要由疏水氨基酸残基组成，HA靠这一部分插入病毒囊膜的脂质双层。最末端的10个氨基酸残基多数是亲水性的，因此可伸出脂质双层进入病毒粒子内。HA是一种糖蛋白，每一个HA单体分子上带有7个寡糖链，其中6个在HA1，

25、1个在HA2。这些寡糖链都通过N葡萄糖苷键与天门冬氨酸残基相连。HA中寡糖的总量约占20%，主要由氨基葡萄糖组成，一些甘露糖形成枝状结构，此外还有少量的岩藻糖，其最外端是半乳糖。在其它病毒糖蛋白的寡糖末端常带有唾液酸(N乙酰神经氨酸)，但流感病毒没有，这是由于病毒粒子含有神经氨酸酶的缘故。 目前对大多数亚型的HA已经测序，通过序列比较发现半胱氨酸残基在所有亚型的序列中都很保守。这表明它们从一个共同的“祖先”进化而来，并且表明它们的结构都相似。通过部分氨基酸序列的比较发现，H1和H3亚型差别最大，仅25%的同源性；其它亚型之间的同源性较高，H2与H5亚型HA之间序列的同源性最高，为80%；相同亚

26、型的不同毒株之间，HA序列的同源性在90%以上。HA的三维结构: 流感病毒囊膜表面的纤突是三个HA聚合在一起形成的三聚体。用去污剂将病毒粒子裂解后可分离到完整的HA纤突。当把去污剂除去后，HA分子靠其疏水端聚集在一起形成玫瑰花样。用蛋白水解酶(如菠萝蛋白酶)消化某些毒株，可分离到不完整的HA分子。 HA纤突由三个HA单体分子组成，单体可分为两部分，一部分是呈球状的头部，含有受体结合位点和抗原决定簇；另一部分为柄，与囊膜相连，长约7.6nm。三聚体的总长为13.5nm。 用X线衍射技术对HA研究的结果表明，HA1的氨基端和HA2的羧基端位于分子的末端，并且靠近囊膜。球状头部由HA1组成，茎部由H

27、A2和部分HA1组成。在HA头部和茎部各单体之间都有局部接触，这样使之形成的三聚体更加稳固。图18-3 流感病毒血凝素突起结构示意图6神经氨酸酶(NA) 神经氨酸酶是流感病毒粒子表面的另一重要抗原。NA可水解细胞表面受体特异性糖蛋白末端的N乙酰基神经氨酸。病毒在细胞表面成熟时，NA可以移去细胞膜出芽点上的神经氨酸，有利于病毒粒子的成熟和释放。它具有免疫原性，能诱发相应的抗体。NA抗体可以抑制酶活性，并具有免疫保护作用。NA亚单位为四聚体，呈哑铃状，外端呈钉帽状，大小为9×5nm，内端呈结节状，直径4nm，像树根一样植入于脂质层内，两端由一长10nm的杆相连。NA亚单位的分子量为200

28、kDa，它是由二个相同的并由二硫键连接的55kDa糖蛋白的二聚物，即由4个单体NA所组成，见图18-4。NA的酶活性可以进行定量测定。HA和NA是甲、乙型流感病毒的两种糖蛋白，而丙型流感则有一种糖蛋白，即血凝素酯酶(hemagglutininesterase，HE)，具有HA的特性，又具有NA的酯酶活性。但丙型流感不具有NA活性。用去污剂、脂溶剂或蛋白水解酶(如胰蛋白酶、枯草菌素、链霉蛋白酶)处理，可使NA纤突从病毒粒子上释放下来。通过电子显微镜观察，发现释放的NA纤突呈蘑菇状。除掉去污剂后，这些纤突可通过疏水的茎部聚集在一起呈玫瑰花形。链霉蛋白酶处理释放的纤突，具有完整的酶活性和抗原性。病毒

29、囊膜上的NA纤突是NA单体形成的四聚体，它包括一个蘑菇状的头部和一个细茎。图18-4. 流感病毒神经氨酸酶结构示意图 NA是一种糖蛋白，其蛋白部分由片段6编码。目前对绝大多数亚型毒株的片段6序列已经清楚，并能从基因序列推测出其氨基酸序列。通过对去污剂处理后释放的NA进行部分氨基酸序列分析，发现与基因推测的序列很一致。NA蛋白质序列的特点是翻译后不经过切割；信号肽不被除去；翻译起始用的蛋氨酸仍然存在；羧基端也不曾经过加工。 NA与HA不同，它属于II类糖蛋白，即氨基端在囊膜内而羧基端在囊膜外，与HA正好相反。NA的一级结构包括4个区域，分别为氨基端胞浆尾、非极性跨膜区、茎部和头部序列。NA的氨基

30、端胞浆尾包括6个氨基酸残基。根据目前所检测的不同亚型的NA序列，发现氨基端胞浆尾非常保守，在所有的甲型流感病毒中都相同。这表明这一序列可能具有重要功能，但其真正功能目前还不清楚。 NA的非极性跨膜区包括氨基端7到35位的氨基酸残基，其中前6个比较保守，其余2325个氨基酸变异较大。 用去污剂和链霉蛋白酶处理提取NA后进行序列分析，证明非极性跨膜区的作用是将NA固定于脂质双层；NA合成后在内质网的运输过程中，这一序列起信号肽的作用。非极性跨膜区的长度在不同的亚型之间有差别。NA的茎部长度及序列在不同的毒株也有很大的差异。茎部的主要功能是帮助形成NA四聚体，当四聚体形成后，用链霉蛋白酶可将其茎部切

31、下，而剩余的四聚体头部仍可保持正常的结构，并且抗原和酶活性都不受影响。茎部是否还有其它功能，目前还不清楚。NA的头部序列在不同亚型的毒株有较高的同源性(46%)，这一点与茎部和非极性跨膜区不同。 用链霉蛋白酶处理将 NA茎部和跨膜区除去，获得NA的四聚体头部，通过X线晶体衍射技术研究表明，四聚体头部大小为10.0nm×10.0nm×6.0nm，由4个相同的单体构成。每一个单体由6个折叠组成，每个折叠又由4条反平行排列的肽链组成。每个折叠的立体构型都相同，呈螺旋桨叶片状，按逆时针方向排列。连接链的茎环结构在不同亚型之间的差异，其氨基酸的变化是造成NA酶活性和抗原性变异的原因。

32、NA酶活性的催化中心位于头部顶端，呈凹隐状，每个NA单体都有一个，所以HA纤突具有4个催化中心。研究表明，每个NA纤突有4个抗原位点，每个位点又含有多个抗原决定簇。另外，流感病毒的囊膜上还存在一定数量的脂质和宿主抗原成分。脂质由内、外两层构成，紧靠于内膜蛋白之外。脂质占病毒粒子总重量的20%25%，使病毒对乙醚和其它脂溶剂敏感。HA和NA亚单位的疏水性末端即植入于这个脂质层内。流感病毒的脂质与副粘病毒相似，主要来自宿主细胞，由磷脂、胆固醇和三甘油脂组成，其中磷脂和胆固醇占95%以上。在不同种动物细胞中生长的流感病毒粒子，带有各该动物细胞的宿主抗原。例如，在鸡胚细胞中培养的病毒，给家兔进行免疫注

33、射，不仅使其产生抗病毒抗体，而且还能产生抗鸡胚细胞的抗体。宿主抗原占病毒总重量的5%，分子量为15kDa，大部分是糖。宿主抗原连结于病毒表面蛋白上，可能是HA和NA的糖蛋白中的糖组分。抗宿主抗体主要针对宿主细胞的糖。.抗原性 根椐流感病毒核蛋白(NP)和基质蛋白(MS)抗原性的不同，流感病毒分甲、乙、丙三型，它们之间的抗原性可通过琼脂扩散试验、补体结合试验等加以区别。三个型的流感病毒之间无共同抗原，都能感染人。 甲型流感病毒的抗原性比较复杂。甲型流感病毒在哺乳动物和鸟类中的分布很广，这些病毒大多具有独特的表面抗原(HA和NA)。但也有些病毒与人的流感病毒或其它动物的流感病毒之间具有共同的抗原成

34、分。例如马的A/马/迈阿密/63/(Heq2)、鸭的A/鸭/的A/鸭/乌克兰/62/(Hav7 Neq2)和人的A3型A/香港/1/68(H3N2)株病毒的HA轻链基本相同。再如鸡的A/鸡/罗斯托克/34/(Hav1N1)、鸭的A/鸭的A/鸭/德国/68(Hav6N1)等病毒的NA和人的N1相同。还有一些禽类流感病毒的NA与人的N2相同。必须指出，从不同宿主体内分离获得的甲型流感病毒具有共同的亚型名称，并不必然意味着这些病毒是从一种动物(或人)自然地传播给另一种动物(或人)。郭元吉等通过血清学调查，认为人的绝大多数甲型流感病毒能自然感染家禽、家畜，并进一步支持人甲型流感病毒新亚型可能来源于动物

35、的观点。在鸭血清中发现甲2型血抑抗体。甲2型自1968年起就从人群中消失，但却迄今存在于鸭中。已有证据说明流感病毒可以在火鸡和猪之间发生传播。各种甲型流感病毒具有共同的型特异性核蛋白和内膜蛋白。在补体结合试验中呈现交叉反应。但用红细胞凝集抑制试验、中和试验、株特异性补体结合试验、ELISA可以检出它们之间的表面抗原。必须指出，在马流感病毒和禽流感病毒之间，存在交叉血凝抑制和补体结合反应。例如，马甲1型流感病毒与禽流感病毒有关，马甲2型流感病毒又与英国鸭流感病毒62毒株和加拿大火鸡63毒株有关，猪流感病毒与人的甲型流感病毒之间也有抗原关系等等。人的甲型流感病毒，其表面抗原(HA和NA)不断地发生

36、变化。这两种表面抗原可以同时发生变异，但更经常的是单独变异；有时是HA变异较大，而NA的变异不明显；有时NA变异较大，而HA的变异不明显。自1933年第一次分离获得流感病毒以来，每隔1013年发生一次大的质变，迄今已先后出现过四次大变异，出现了甲0、甲1、甲2和甲3等4个新的亚型病毒，每次都引起了人间的大流行。在每个大变异(1013年)之间，又有许多小变异(量变)，出现小变种，引起中、小流行。这是由于病毒发生变异后，人群原有的免疫力相应失效的缘故。较大的变异使人群的免疫力基本失效，引起大流行；较小的变异则能部分地战胜人群的免疫力，引起较小的流行。人们对于HA或NA抗原的巨大“间断性”变化(如H

37、2H3)，叫做抗原转变(antigenic shift)，而年复一年的在H2或在H3中查出的微小变化叫做抗原漂移(antigenic drift)。不同亚型的糖蛋白氨基酸序列有很大差异。糖蛋白基因序列分析及单克隆抗体中和试验的研究结果表明，H3分子至少有3个不同位点发生改变才可能引起部分流行。马流感病毒的抗原性比较稳定。在已分离到的许多毒株中，应用血凝抑制试验、中和试验和ELISA1，迄今只发现两个亚型，即甲1型和甲2型。马甲1型病毒是1956年分离获得的，至今已近40多年。马甲2型病毒是1963年分离获得的，至今已经30年。这两个亚型毒株，虽在历次的流行中见到过微小的抗原变化，但都没有发生变

38、异。我国于1974年分离的马甲1型病毒与1956年从布拉格分离的马甲1型病毒的抗原比(r值)为11.49，说明这两株病毒的抗原无明显区别。但是荷兰19781979年暴发由马流感甲2病毒(Heq2 Neq2)引起的马流感，已经接种A/布拉格/56(马甲1原亚型)和A/迈阿密/63(马甲2型原亚型)疫苗的马也被感染而且出现临床症状。值得注意的是用A/迈阿密/63株病毒感染雪貂，不能使其产生对1979年分离株的血凝抑制抗体。但是荷兰1270/79或荷兰1288/79株病毒感染的雪貂，其血清中含有的血凝抑制抗体对A/迈阿密/63以及1968和1979年的荷兰分离株具有大致相同的抗体滴度。以荷兰1979

39、年分离株接种，可以保护除A/迈阿密/63株病毒以外的其它荷兰株的感染。据此认为，19781979年分离自荷兰的毒株已经与A/迈阿密/63原亚型不同，也就是发生了明显的抗原性变化。禽的流感病毒具有13个不同的HA和9个不同的NA，近年的报道已有16个不同的HA亚型。这两种表面抗原的不同组合，构成不同的毒株。猪的流感病毒毒株具有相同或相似的表面抗原，但也常见发生一些小的变化，因此可用血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验鉴别出不同的毒株。此外，人的流感病毒可以自然感染其它动物，如人甲3型病毒能自然感染猪，并从猪体内分离获得了A/台湾/69(H3N2)株，其表面抗原和人的A/香港/1/68(H3N2)完全

40、一样。四、流感病毒的复制周期与分子感染机理 (2)病毒基因组的复制与转录: 流感病毒复制时可产生两种基因转录物：一种是A(+)cRNA，其功能相当于mRNA； 另一种是A()cRNA，是病毒复制时产生vRNA的模板。病毒RNA在细胞内最先转录出mRNA(+)cRNA，这一过程称初始转录。子代病毒RNA分子的产生称为二级转录，这一过程是用A()cRNA作模板合成vRNA。流感病毒与其它RNA病毒(如小RNA病毒)不同，它不能在去核的细胞内复制，而且紫外线照射、放线菌素D或丝裂酶素C都可以阻断病毒的增殖。上述药物只能在RNA合成之前，即感染后前2小时之内有此作用。但是DNA合成的化学抑制物(如阿糖

41、胞苷AraC)，不能降低感染病毒的增殖。因此，功能性宿主DNA，而不是复制型宿主DNA，是流感病毒增殖的早期过程所必需的。实际上，宿主细胞的mRNA对流感病毒RNA的复制和转录也是需要的，因为宿主细胞mRNA的5端1015个核苷酸以及其帽子结构，可转移到病毒裸露mRNA的5端，也可作为病毒基因组转录的引物。证明流感病毒的复制需要宿主细胞RNA多聚酶的参与。流感病毒的初始转录: 流感病毒的初始转录(mRNA的合成)包括引物RNA的切割、合成启始、链的延长和终止等几个过程，由病毒转录酶复合体(包括PB1、PB2、PA和NP)来完成。首先，病毒核酸酶PB2结合到宿主mRNA的5端并切下1013个核苷

42、酸，这一序列带有帽子结构，可直接作为引物。一般的核酸酶切割后产生的3端带有磷酸，而流感病毒的核酸内切酶切割后可产生3端OH基，因此切下的寡核苷酸不需要去磷酸化即可直接作引物。流感病毒核酸内切酶作用的发挥要求帽子上有m7G，其合适的切割位点在嘌呤的3端，并且距离是1013个核苷酸，最适切割位点是腺嘌呤核苷的3端。引物加上后，PB1以病毒RNA为模板催化合成的起始和链和延伸。加上去的第一个核苷酸是G，它与病毒RNA3端的第二个核苷酸互补，由此可见，病毒转录酶不转录3端第一个核苷酸(U)。当链延伸到1115个核苷酸长度时，引物从PB2上释放下来，但其3端的A仍保留在mRNA上，因此病毒mRNA的5端

43、仍为AGC。在链的延伸过程中，PB1、PB2和PA一起移动，但PA的作用还不清楚。当链延伸到距模板5端1522个核苷酸处时遇到寡聚U序列，以此为模板合成Poly A尾后使链的延长终止。由此可见病毒mRNA是病毒RNA的不完全转录物。(A)(一)cRNA的合成及病毒基因组复制:(A)(一)cRNA是合成子代病毒基因组的模板，可在感染的宿主细胞内发现，它是病毒RNA的完全转录物，5末端是pppA，3端没有Poly A尾。流感病毒mRNA的合成在无病毒蛋白质合成的情况下即可进行，而(A)(一)cRNA不同，必须在有功能性病毒蛋白合成后才能进行，因此其合成出现的时间比mRNA晚。一般认为合成 (A)(

44、一)cRNA所需要的酶也是病毒聚合酶复合体，但病毒的某些蛋白质(如NS1、NS2和M2)也参与这一转录过程。其转录的特点是不需要引物即可起始；转录时由于病毒蛋白质的参与，能通过模板上的Poly U区到达5末端。病毒聚合酶复合体中每种成分在转录过程中的作用还不十分清楚。流感病毒8个片段或7个片段的末端序列都相同，因此转录酶识别每个片段的机会是均等的，这样每个片段转录(A)(一)cRNA率都相同。(A)(一)cRNA合成后可作为模板，在转录酶复合体的催化下忠实地转录出子代病毒RNA。RNA合成的调节: 在流感病毒感染过程中，三种病毒RNAmRNA、(A)(一)cRNA和vRNA的合成速度受到某种机

45、制的调节。感染后最先合成的是mRNA，几乎在感染后马上就能检测到，因为mRNA的合成只需要病毒多聚酶复合体及宿主mRNA的帽状结构，不需要其它的病毒蛋白质的协助。mRNA的合成在感染后2小时可达到高峰。在检测到mRNA后很快即可检测到(A)(一)cRNA，不过其合成高峰出现的时间可能比mRNA的还早。(A)(一)cRNA合成后很快复制出vRNA。(3)病毒的增殖吸附、穿膜和脱壳 流感病毒与其它病毒一样，感染的第一步是病毒与细胞上的特异受体相互作用，使病毒吸附于细胞表面。流感病毒的受体结合位点位于HA头部顶端，细胞受体是位于细胞膜糖蛋白或糖脂链末端的唾液酸。吸附后病毒粒子经吞饮作用进入细胞浆，与

46、酸性溶酶体发生融合，这样可使流感病毒周围的pH下降到5.0。在这种酸性环境中，HA的构型发生很大变化，使HA2的氨基端游离出来并插入吞噬泡膜的脂质双层，促使病毒囊膜与吞噬泡膜融合并破裂，最后病毒核衣壳释放到细胞浆内。病毒基因组的复制及其它成分的合成 流感病毒基因组为负链RNA，就是说病毒基因组RNA不能作为模板翻译蛋白质，必须首先合成mRNA才能进行蛋白质的合成。因此病毒脱去囊膜后其核酸片段进入宿主细胞核，在病毒本身携带的聚合酶复合体催化下，以宿主细胞mRNA5端序列作引物开始初级转录，即产生mRNA。产生的病毒mRNA进入细胞质用于翻译病毒蛋白质。在感染的初期，产生的蛋白质主要是NP和NS1

47、，这时宿主细胞mRNA的翻译被阻断，新合成的NP和NS1又进入细胞核，当在核内聚集到一定浓度后，使病毒mRNA的合成速度下降，开始A(一)cRNA和vRNA的合成。新合成的vRNA在核内与NP组成复合体，又可作为模板转录病毒mRNA。流感病毒的糖成分主要存在于囊膜上，是糖蛋白和糖脂的组分。糖脂成分来源于宿主细胞，糖蛋白中的寡糖侧链由宿主细胞的转移酶合成。病毒囊膜的类脂成分也来源于宿主细胞膜。病毒粒子的装配有关流感病毒粒子的详细装配过程目前还不清楚。一般认为NP在细胞浆合成首先以游离状态存在，但很快进入细胞核与vRNA结合形成核壳体。最近研究表明，M1在细胞核内聚集到一定程度可促使核壳体从细胞核

48、进入细胞质。基因组片段被NP包围后可形成一种串联结构，但其形成机制还不清楚，因为每一片段的末端序列都相同，在不同片段之间很难找到配对序列。有人认为NP之间的相互作用可将它们联在一起，但是还没有直接证据。基质蛋白(M1)合成后到达细胞膜，紧贴在细胞膜内侧面，在此处的胞膜上有HA和NA形成的纤突。核衣壳形成后移向这一区域准备出芽。在每一个感染性病毒粒子中都含有8个或7个不同的基因组片段，在病毒装配过程中如何只包装8个或7个不同的片段而不出现差错，目前还是一个悬而未决的问题。病毒的出芽和释放 M1合成后到达细胞膜，与HA、NA或M2的胞浆域之间相互作用可能是病毒出芽的信号。病毒释放过程中NA起很重要

49、的作用。NA可去掉病毒囊膜上的神经氨酸，避免子代病毒在细胞膜上聚集。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶将HA裂解为HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性。五、流感病毒的遗传与变异甲型流感病毒每个核苷酸在每个复制周期中的突变机率大约是1.5×105，与其它RNA病毒的突变率相似。但是，由于流感病毒的基因组分为8个或7个不同的节段，在病毒增殖过程中很容易发生基因重排，因而使流感病毒的抗原性和致病性很容易发生变异。流感病毒变异主要包括以下几种类型。1抗原性变异抗原性变异是甲型流感病毒常见的一种自然变异，同时在实验室内用抗体也可筛选到抗原变异株。变异率最高的是HA，其次是NA。这两种抗原的变异

50、可独立发生，有时只涉及一个(HA或NA)，有时两个同时发生变异。根据抗原性变异的程度可将其分为两种：抗原漂移和抗原转变。A.抗原漂移(antigenic drift)： 由于基因组自发的点突变引起小幅度的变异，当氨基酸的改变积累到一定程度或突变氨基酸正好使抗原决定簇改变，则引起抗原性的变异，这种变异称为抗原漂移。由于RNA聚合酶缺乏校正功能，在病毒基因组复制时容易出现差错，因此RNA病毒的突变率比DNA病毒高。流感病毒HA基因的变异率最高，据估计每个复制周期中每个核苷酸的突变机率为2×103，也就是说病毒每复制一代，HA基因上大约有一个碱基发生变异。HA发生变异可能与抗体的压力筛选有

51、关，但其突变的准确机制还不清楚。用单克隆抗体对禽流感病毒HA的抗原性进行分析，发现抗原漂移率比人流感病毒低，并且多种不同的变异株可同时在禽类中循环存在。禽流感病毒HA变异率较低的原因可能是由于免疫系统对病毒变异的压力不够，因为已经发现禽类感染流感病毒后，其抗体持续时间较短。另外禽类的寿命比人短得多。流感病毒的NA也常发生抗原漂移。如用单克隆抗体对A/Tokyo/3/67(H2N2)进行筛选，在鸡胚上传一代即可筛选到突变株。B.抗原转变(antigenic shift): 由于突变幅度较大导致产生新的亚型，这种变异称为抗原转变。变异涉及抗原的数量和幅度大小并常直接影响流行的规模。抗原转变在人流感

52、的发生历史上表现很明显，例如，1957年H2N2亚型的出现代替了H1N1亚型，1968年H3N2亚型毒株引起流感暴发，1977年又出现了H1N1亚型的流行。从HA的氨基酸序列来看，H2与H5的亚型比较接近，突变的积累有可能造成两者抗原性互相转变，而H2与H3之间有很大差别，仅靠点突变使H2转变为H3可能需要相当长的时间。为什么H3亚型能在10年左右的时间内取代H2出现流行? 其原因有多种解释。一种解释认为，这种新流行的毒株是通过与其它动物(包括禽类)流感病毒的基因发生重排而出现的。大量试验已经证明，不同亚型的病毒同时感染一个细胞，病毒基因组可在细胞中发生重排,即基因片段发生交换。研究表明，19

53、57年和1968年流行的毒株就是由基因重排产生的。1957年毒株的HA和NA的基因序列与H1N1毒株有很大的差异，但经序列分析和杂交试验证明，其余6个片段中至少有5个片段基本相同，1968年流行的毒株与1957年流行的毒株的HA虽然不同，但含有相同的NA，都为N2。另外发现1968年毒株的HA(H3)与一株禽流感病毒的HA具有98%的同源性，因此推测新毒株的HA基因很可能来自禽流感病毒。第二种观点认为，这种新流行的毒株可能在许多年前就已存在并流行过，但后来这一毒株隐藏在某个地方一直没有发生变化，在适当的条件下这一毒株又“复苏”增殖，引起新的暴发流行。例如1977年流行的H1N1亚型毒株与195

54、0年流行的完全相同。如何解释在长达27年的时间内两个流行株的基因没有发生变化。有人认为动物保藏宿主将这一毒株保存下来，最后又传播给人造成流感暴发。但是在如此长的时间内不发生抗原漂移，令人难以置信。另有人认为病毒基因插入宿主基因组，但目前看来这是一种无根据的假设。第三种解释是病毒在自然界一直处于冰冻状态中，没有增殖的机会也就不会发生变异，但仍保持有感染性，遇有适当条件则重新造成暴发。另外一种解释是动物病毒发生变异，造成人的感染，引起新的流感暴发。但是，病毒基因组需要发生多大变化才能造成人的感染，目前还不清楚。2致病性变异a.条件致死性变种和温度敏感(ts)变种：条件致死性变种是指在某种条件下不能

55、增殖，但在另一种条件下却能增殖并产生子代病毒的变种。这种可在一个或几个不同基因片段上的任何一点发生突变或损伤，使其生物学特性发生改变。研究最多的是温度敏感(ts)变种。ts变种能在33增殖，但和野毒株不同，3739培养时不能增殖或增殖不好。ts变种通过基因重排、互补、变温试验以及RNA片段电泳迁移率测定等方法可以用来研究病毒的基因功能。另外，由于ts变种比野毒株的致病力弱，因此可用作减毒疫苗株或作为基因供体用于选择弱毒株。b.冷适应变种：用野毒株感染鸡胚在较低温度下(2530)培养，连续传代后可较快地使病毒的致病力减弱。这一方法可用于减毒活疫苗株的选育和生产。c.新宿主适应变种：流感病毒在某种培养系统中连续传代后，其增殖滴度和致病性均可逐渐升高，出现对新宿主的适应性变异。3病毒基因组变异A.基因重排(reassortment): 甲型流感病毒有8个基因组片段，当两个或两个以上的不同病毒粒子同时感染一个宿主细胞时，在病毒的增殖过程中，不同毒粒的8个基因组片段可以随机互相交换，从而发生核酸片段水平上的重新组合，这种现象就称为基因重排。甲型流感病毒的HA已鉴定出18种，NA已有10种。如果HA和NA基因能够随意重排，则可产