蛋白质的分离、纯化

1、会计学1蛋白质的分离、纯化蛋白质的分离、纯化( (七七) ) 毛细管电泳测定蛋白质的分子质量毛细管电泳测定蛋白质的分子质量 毛细管电泳（毛细管电泳（CECE）则可以在很大程度上克服常）则可以在很大程度上克服常规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳规方法时间长、灵敏芽低不利情况。用毛细管电泳测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可测定蛋白质分子量仅需要纳克量蛋白质，而且还可以用积分仪或电脑联机精确定量。以用积分仪或电脑联机精确定量。 ( (八八) )质谱测定蛋白质分子量质谱测定蛋白质分子量 质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新质谱测定蛋白质分子量是近年来发展的一项新技术，其分辨率和

2、精确度都较前几项技术高。尤其技术，其分辨率和精确度都较前几项技术高。尤其近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量近几年发展起来的磁质谱可精确测定分子质量2000Da2000Da以下的多肽；而电喷雾质谱（以下的多肽；而电喷雾质谱（ESIESI）可以测）可以测5 5万万DaDa的蛋白质，而且只需要皮摩尔（的蛋白质，而且只需要皮摩尔（pmolpmol）量的蛋）量的蛋白质，精确度为白质，精确度为0.01%0.01%。 材料获得：（一）天然材料：（一）天然材料：新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。 e.g.e.g.钙调素：钙调素：动物的脑组织，植物花粉 胰蛋白酶抑制剂

3、：胰蛋白酶抑制剂：大豆种子 溶菌酶：溶菌酶：鸡蛋清 抗体：抗体：血清（二）基因工程产物：（二）基因工程产物：对于天然不易得到的蛋白，通过工对于天然不易得到的蛋白，通过工 程菌或工程细胞表达而获得。程菌或工程细胞表达而获得。粗分离粗分离（一）破细胞（一）破细胞动物，植物细胞：匀浆，研磨匀浆，研磨大肠杆菌：冻融，超声，溶菌酶冻融，超声，溶菌酶（二）抽提（二）抽提 1. pH：选择合适选择合适pHpH的缓冲液，如的缓冲液，如TrisTris，磷，磷酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分酸盐，醋酸盐，柠檬酸盐缓冲体系，保证待分离蛋白在此离蛋白在此pHpH条件下稳定。一般缓冲液浓度为条件下稳定。一般缓

4、冲液浓度为202050mM50mM。 2.温度：低温如低温如4 41010，蛋白酶活性较低，蛋白酶活性较低。 3.离子强度：如如0.10.10.2 M NaCl0.2 M NaCl或或KCl.KCl. 4.其他成分：还原剂如还原剂如NaHSONaHSO4 4，维生素，维生素C C；巯基保护剂巯基保护剂DTTDTT，巯基乙醇；金属螯合剂，巯基乙醇；金属螯合剂EDTAEDTA，EGTAEGTA；蛋白酶抑制剂；蛋白酶抑制剂PMSFPMSF。（三）初步分离（三）初步分离 1.1.分离细胞器：分离细胞器：离心，超离心 2.2.除核酸：除核酸：酶法DNase,RNase；超声 3.3.除脂肪：除脂肪：丙酮

5、，脂肪酶（四）粗分蛋白（四）粗分蛋白 1.1.盐析：盐析：NaCl，(NH4)2SO4沉淀 2.2.有机溶剂抽提：有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3.3.等电点沉淀：等电点沉淀：除去杂蛋白 4.4.热变性：热变性：除去杂蛋白（五）除盐（五）除盐 1.1.超滤超滤 2.2.凝胶过滤凝胶过滤 3.3.冻干冻干 凝胶珠-多孔的网状结构交联度or孔度（网孔大小）决定凝胶的分级范围，即能被该凝胶分离开来的蛋白质混合度的分子量范围。排阻极限表示分级范围的上限，不能扩散进入凝胶珠微孔的最小分子量的分子量。 处理介质处理介质装柱装柱平衡平衡上样上样洗涤洗涤洗脱洗脱介质再生介质再生层层析析的的一一般般步步骤骤糜

6、蛋白酶糜蛋白酶, ,胰蛋白酶及其前体的制备胰蛋白酶及其前体的制备 1975 1975年，年，O OFarrell Farrell 首先运用双向电泳技术将大首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出肠杆菌总蛋白分离出11001100多个蛋白点。后来此技术一多个蛋白点。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。于发现未知蛋白。 双向电泳由第一向等电聚焦双向电泳由第一向等电聚焦(IEF)(IEF)电泳和第二向电泳和第二向SDS-SD

7、S-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)组成，第一向使组成，第一向使等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的等电点不同的蛋白得到分离，第二向使分子量不同的蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱蛋白得到分离，两向结合便得到高分辨率的蛋白图谱。I I 分类：分类： 阴离子交换阴离子交换 强度强度 功能基团功能基团 + + DEAE DEAE 中等中等 OCHOCH2 2CHCH2 2NH(CHNH(CH2 2CHCH3 3) )2 2 + + QAE QAE 强强 OCHOCH2 2CHCH2 2NH(CHNH(CH2 2CHCH3 3) )2

8、 2CHCH2 2CHCH3 3 阳离子交换阳离子交换 强度强度 功能基团功能基团 CM CM 弱弱 OCHOCH2 2COOCOO- - SP SP 强强 CHCH2 2CHCH2 2CHCH2 2SOSO3 3- -II II 选择：选择： i i 根据蛋白质的等电点选择介质根据蛋白质的等电点选择介质 ii ii 根据分离目的选择介质根据分离目的选择介质例如：例如： 离子交换纤维素纤维素为交换基质原理：具有松散的亲水性网状结构，吸较大的表面积，大分子可以自由通过优点：交换容量大洗脱条件温和回收率高品种多，选择范围广 注意的问题：注意的问题： (1) (1) 缓冲液的选择缓冲液的选择： 阳离

9、子：Tris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2) (2) 介质处理：介质处理： 阳离子： Na+ 型 阴离子： Cl- 型 (3) (3) 洗脱：洗脱：原理：i改变盐浓度 ii改变pH值方式：i分步洗脱 ii梯度洗脱 (4) (4) 介质再生介质再生1 原理：利用蛋白质特异性进行分离。利用蛋白质特异性进行分离。2 介质准备： 载体选择：Sepharose 4BSepharose 4BSepharose CL4B,Sepharose CL4B,Sepharose Fast Flow,Sepharose Fast Flow,Sepharose High PerformanceSepharose Hi

10、gh Performance 空间臂：偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二偶联小分子时需要空间臂，常为双功能基团，如己二氨或氨或氨基己酸。氨基己酸。 3 3 配基选择：配基选择： 抗原抗原抗体，酶抗体，酶抑制剂，酶抑制剂，酶底物，底物，激素激素受体，金属结合蛋白受体，金属结合蛋白螯和剂，螯和剂， 含巯基蛋含巯基蛋白白HgHg或含巯基分子，凝集素或含巯基分子，凝集素糖蛋白糖蛋白4 4 偶联：偶联： I I 溴化氰法溴化氰法：与：与氨基或氨基或氨基偶联。氨基偶联。 效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。效率高，反应时间短，条件温和，适于多种蛋白。 II II 环氧氯丙烷法：环氧氯丙

11、烷法：与与NHNH2 2, OH, SH , OH, SH 偶联偶联 偶联时需强烈条件，如偶联时需强烈条件，如pH11pH11，40405050，适于特别，适于特别稳定的蛋白稳定的蛋白（一）浓度（一）浓度/ /含量测定含量测定 1 1 紫外法：紫外法：蛋白质的芳香族氨基酸在280nm 有吸收。 2 Lowry2 Lowry法法：蛋白质在碱性溶液中与铜形成复合物，此复合物及芳香族氨基酸还原磷钼酸磷钨酸试剂产生蓝色。 3 Bradford3 Bradford法：法：蛋白质与考马斯亮蓝染料的结合量。 4 4 凯氏定氮法凯氏定氮法 5 5 双缩脲法双缩脲法溶菌酶：溶菌酶： 分子量为分子量为14KD14

12、KD， 等电点为等电点为1111，耐热，耐热，能够水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡能够水解革兰氏阳性细菌的细胞壁，鸡蛋清中含量丰富。蛋清中含量丰富。举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶举例：从鸡蛋壳膜中制备溶菌酶 纯化步骤：纯化步骤：150150克鸡蛋壳，克鸡蛋壳，1 1 NaClNaCl0.05 N HCl ,400.05 N HCl ,40抽提抽提2020醋酸调醋酸调pH4.6pH4.6，7575处理处理3 3分钟，离心取上清分钟，离心取上清加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量加聚丙烯酸，收集沉淀，在沉淀中加入少量5050的的CaClCaCl2 2，离心取上清，离心取上清在上清中加在上清中加NaClNaCl至终浓度至终浓度5 5，将样品加到，将样品加到Sephadex G-50Sephadex G-50层析柱中层析柱中(5X25cm)(5X25cm)，0.6% NaCl0.6% NaCl洗脱，流速洗脱，流速4040毫升毫升/ /小时，收集洗脱液小时，收集洗脱液5ml/5ml/管管测活，合并含溶菌酶部分测活，合并含溶菌酶部分聚乙二醇浓缩聚乙二醇浓缩结晶结晶蛋白质的分离纯化小结 1 材料获得：材料获得： 天然获得新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。新鲜，含量丰富，易于提取，价格便宜。； 基因工程手段获得对于天然不易得到