蛋白质的分离纯化

1、会计学1蛋白质的分离纯化蛋白质的分离纯化2n 发酵工程（细胞扩增）34n 细胞工程56n 细胞工程 一些单细胞低等植物如单细胞藻类的大规模培养成为细胞工程的重要组成部分 获得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等78910111213141516溶解度溶解度盐浓度盐浓度Salting-out17脱水脱水脱水脱水脱水脱水带负电荷蛋白质（疏水胶体）阴离子阴离子阳离子阳离子碱碱酸酸酸酸碱碱水化膜水化膜带正电荷蛋白质（疏水胶体）18192021血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白(NH(NH4 4) )2 2SOSO4 450%50%饱和度饱和度饱和饱和析出析出析出析出222324252627282930

2、加压的蛋白质溶液浓缩的蛋白质溶液含小分子的溶液313233 常用的层析方法凝胶过滤离子交换层析疏水层析反相层析亲和层析3435类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、 葡聚糖葡聚糖亲和层析亲

3、和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）36原理原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同，

4、当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被解吸，然后又再被吸附、再解吸再吸附程度地被解吸，然后又再被吸附、再解吸再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。，从而以不同速度随流动相向前移动。 载体载体 ： 硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷灰石羟基磷灰石37原理原理 （见后）（见后）基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 除去热原物质除去热原物质383940用于凝胶过滤的凝胶有多种，基本结构为内部带有孔洞的球状颗粒。装入玻璃管或不锈钢管内，叫做凝胶

5、层析柱。待分离的混合物加在层析柱的上端，当混合物向下移动时，大分子不进入凝胶的内部孔洞，从凝胶颗粒之间移动；而小分子不但在凝胶颗粒之间移动，还会进入凝胶颗粒的内部孔洞，这样，大分子先从层析柱底端流出，小分子晚流出。达到分离的目的。41 应应用用4243离子交换层析离子交换介质是一些表面带有电荷的颗粒，可以结合带有异性电荷的离子。蛋白质或核酸的分子，一般都带有电荷，不同的蛋白质或核酸，携带的电荷可能有差异，根据这些差异，进行蛋白质或核酸的分离。441.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂与反离子结合离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换吸附阶段：样品与反离子进行交换3、4. 解吸附阶段

6、：用梯度缓冲溶液洗脱，先解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质5.再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤， 即可重复使用。即可重复使用。4512345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子46疏水层析疏水层析的介质表面有疏水基团，可与蛋白质分子的疏水基团结合，不同的蛋白质分子结合的力量不同，也可实现混合物分离的目的。47484950加压的蛋白质溶液浓缩的蛋白质溶液含小分子的溶液51类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝

7、、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、 葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）52原理原理：以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同，当流动相从固定相