仪器分析荧光分析法2ppt课件

1、第十二章 荧光分析法fluorometry概概 述述 某些物质受到光照射时，除吸收某种波长的光之外还会发射出比原来所吸收的光的波长更长的光，这种现象称为光致发光，最常见的光致发光现象是荧光和磷光。 荧光的分类荧光的分类 根据物质是分子还是原子：分子荧光 原子荧光 根据照射光的种类：紫外荧光 X射线荧光 红外荧光方法测定灵敏度方法测定灵敏度 10-10 10-12g/ml 第一节第一节 基本原理基本原理一、分子荧光一、分子荧光（一分子荧光的产生（一分子荧光的产生1分子的电子能级与激发过程分子的电子能级与激发过程 =hcES0S1*T1S0V= 0123S1*S2*VnT1*荧光与磷光产生示意图荧

2、光与磷光产生示意图2.荧光和磷光产生荧光和磷光产生（二激发光谱与发射光谱（二激发光谱与发射光谱光光源源单单色色器器1单色器单色器2检测器检测器excitation spectrum 横坐标横坐标 ex，纵坐，纵坐标标 发射光强度发射光强度fluorescence spectrum 横坐标横坐标 em，纵坐，纵坐标标 发射光强度发射光强度溶液荧光光谱通常具有如下特征溶液荧光光谱通常具有如下特征斯托克斯位移斯托克斯位移 = - 荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关 不管分子激发到s1还是s2，荧光的发生总是从s1开始，荧光光谱的形状是一样的。荧荧光光强强度度 (nm)40030

3、0500荧荧光光强强度度nm250350V=01234S0S1*12340蒽的激发光谱和发射光谱蒽的激发光谱和发射光谱荧光光谱的形状与激发波长无关荧光光谱的形状与激发波长无关除去激发光源后，荧光强度降低到最大荧光强度的1/e的时间二、荧光与分子结构二、荧光与分子结构（一荧光寿命和荧光效率（一荧光寿命和荧光效率 fluorescence lift time， f Ft=F0e-Kt 当当t= f 时，时，Ft=（1/eF0 （ 1/eF0 = F0e-K f 即即1/e）= e-K f K f= 1 K = 1/ fFt = F0 e -Ft = F0 e -t /t / f f求荧光寿命Ft

4、= F0 e -t / fln F0Ftt f=ln F0Ftt直线斜率为直线斜率为1 ffluorescence efficiency(fluorescence quantum yield) f =发射荧光的光子数发射荧光的光子数吸收激发光的光子数吸收激发光的光子数 （二有机化合物分子结构与荧光的关系（二有机化合物分子结构与荧光的关系 长共轭结构长共轭结构 分子的刚性分子的刚性 取代基取代基1. 长共轭结构长共轭结构 对于芳香族化合物，共轭越长， ex和em都长移，荧光效率也提高。 ex = 205nm em = 278nm ex = 286nm em = 321nm ex = 356nm

5、em = 404nm f = 0.11 f = 0.36 f = 0.29 长共轭的脂肪烃也有荧光2. 分子的刚性分子的刚性 同样具有*跃迁的长共轭分子中，刚性和共平面性越大， 越大， 长移。CH2 f = 0.2 f = 1.0刚性和共平面性增加刚性和共平面性增加 电子的共轭程度增加电子的共轭程度增加-COO-COO-COO-O荧光素钠酚酞原来不发生荧光的，如：8-羟基喹啉N-OHN-OMg1/2Mg原来共平面性较好的-NCH3CH3SO3NaNCH3CH3SO3Na1-二甲氨基萘二甲氨基萘-7-磺酸盐磺酸盐1-二甲氨基萘二甲氨基萘-8-磺酸盐磺酸盐 取代基的影响取代基的影响 供电子基团 -

6、NH2、-OH、-OCH3 吸电子基团-COOH、-NO2、 -NHCOCH3 -R、-SO3H、-NH3+使 使 影响较小（三荧光试剂（三荧光试剂 荧光胺荧光胺 Dansyl-Cl 邻苯二甲醛邻苯二甲醛(OPA) 测定无机离子的荧光试剂测定无机离子的荧光试剂荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应荧光胺与脂肪族或芳香族伯胺反应COOHONROH-NH2R-NH2 ex 275, 490nm em 480nm OOOODansyl-Cl 与伯仲胺及酚羟基反应与伯仲胺及酚羟基反应NCH3CH3SO2ClNCH3CH3SO2NHR+ RNH2无水丙酮+ HCl ex 365nm em 500nm 邻苯二甲醛

7、邻苯二甲醛(OPA)与伯胺反应与伯胺反应-CHO-CHO+ RNH2 + HSCH2CH2OHN-RSCH2CH2OH+ 2H2OpH 910OH- ex 340nm em 455nm 无机离子一般本身没有荧光，但与一些有无机离子一般本身没有荧光，但与一些有机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光机试剂生成配合物后，可产生强烈荧光N-OHN-OLi+ Li+ ex 370nm em 580nm P235 表12-1有些无机阴离子可使荧光熄灭有些无机阴离子可使荧光熄灭N-OHN-OAl1/3+ Al+ CN-使荧光熄灭或减弱F-三、影响荧光强度的外部因素三、影响荧光强度的外部因素 极性溶剂使K带吸收长

8、移，跃迁几率增大，荧光波长长移，强度增加。 溶剂粘度降低，荧光强度减弱。 溶剂 温度 温度升高 荧光效率下降 pH值的影响NH2NH3+NH-pH13无荧光无荧光pH712 兰色荧光兰色荧光OHHO3S-O-O3S-pH6.4 兰色荧光兰色荧光 荧光熄灭剂的影响 荧光熄灭剂荧光熄灭剂quenching medium发生碰撞而使之失去能量生成不发光的配位化合物溴、碘以及溶解氧的存在，实现体系间跨越，转变成三线态。 荧光熄灭法荧光熄灭法fluordscence quenching method 荧光自熄灭荧光自熄灭C 1 g/l散射光的干扰 scattering light光子与物质分子碰撞弹性碰

9、撞非弹性碰撞碰撞双方能量不变碰撞双方能量不变光子运动方向改变光子运动方向改变碰撞过程中发生能碰撞过程中发生能量传递，同时光子量传递，同时光子运动方向发生改变运动方向发生改变Reyleigh scattering lightRaman scattering light硫酸奎宁在不同硫酸奎宁在不同ex的荧光与散射光的荧光与散射光谱谱Fnm320448350448360400ex 320nmReyleigh 320nmRaman 360nmem 448nmex 350nmReyleigh 350nmRaman 400nmem 448nm对测定无影响对测定无影响对测定有影响对测定有影响在不同波长激发光

10、下主要溶剂的拉曼光波长在不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长 激 发 光（nm） 溶剂 248 313 365 405 436 水 271 350 416 469 511 乙醇 267 344 409 459 500 环己烷 267 344 408 458 499 CCl4 320 375 418 450 CHCl3 346 410 461 502I0IF第三节 定量分析方法一、荧光强度与物质浓度的关系F=K(I0-I)I=I010-ECLF= KI0(1-10-ECL) = KI0(1-e-2.3ECL)e-2.3ECL= 1+F= KI0(1-10-ECL) = KI0(1-e-2.3EC

11、L)(-2.3ECL)11!+ (-2.3ECL)22!F= KI01-(1+(-2.3ECL)11!(-2.3ECL)22!+ )(-2.3ECL)33!+= KI02.303ECl -(-2.3ECL)22!(-2.3ECL)33!-若若C很小，很小，ECl 0.05 则则F=2.3KI0ECl=KC+ F=2.3KI0ECl=KC ECl0.05 F C ECl 0.05 F 与与C不成正比不成正比荧光法荧光法 紫外法紫外法FA= - lgT = - lgI /I0 荧光分析法的灵敏度高于紫外荧光分析法的灵敏度高于紫外-可见分光光度法可见分光光度法二、定量分析方法二、定量分析方法 标准曲

12、线法标准曲线法 比例法比例法 多组分分析多组分分析C1 C2 C3 C4 C5100%20608040 80%16486432用空白溶液调零用空白溶液调零用标准溶液调满刻度用标准溶液调满刻度比例法对比法）比例法对比法） 若在某浓度范围中成线性，可用比例法测定CsCxFsFx=CxFsFx=CsCsCxFs -F0Fx -F0=CxFs -F0Fx -F0=Cs多组分分析多组分分析 各组分荧光峰不重叠，可分别测定 相互重叠，可利用荧光强度的加和性，如：ba 1 2Fa = KaCa + KbCb 1:Fa = Ka Ca + KbCb 2:第四节第四节 仪器与荧光分析新技术仪器与荧光分析新技术光

13、光源源单色器单色器 样品池样品池检测器检测器单色器单色器 放大器放大器显示器显示器滤光片荧光计滤光片单色器荧光分光光度计仪器的校正仪器的校正 灵敏度灵敏度 波长波长 激发光谱和荧光光谱激发光谱和荧光光谱荧光分析新技术简介荧光分析新技术简介1. 激光荧光分析 以激光作光源，谱线更纯、强度更大。 可提高灵敏度和专一性。一次测量所需样品液 1g，可测至10-14 10-16g。新技术新技术仪器方面更新化学方法改善2. 时间分辨荧光时间分辨荧光 time-resolved fluorometry样品样品杂质杂质脉冲激光脉冲激光10-10 s10-12 s3. 同步荧光分析同步荧光分析 synchronous fluorometry假设：假设： = em - exF = K （ ex ）（ em ）CFex