第十四章免疫学检测技术

1、第十四章第十四章 免疫学检测技术免疫学检测技术抗原抗原- -抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度生高度特异性结合特异性结合反应。由于实验所用的抗体存在反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（于血清中，故又称血清学反应（serological serological reaction)reaction)应用：应用：用已知抗原检测未知抗体；用已知抗原检测未知抗体；用已知抗体检测未知抗原：用已知抗体检测未知抗原：定性或定量检测体内各种分子；定性或定量检测体内各种分子；用已知抗体检测半抗原物质。用已知抗体检测半抗原物质。1.1.特异性和交叉

2、反应特异性和交叉反应 特异性特异性：一种抗原通常仅能与：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。由它刺激所产生的抗体结合。分子基础：分子基础：抗原表位与抗体分抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性子高变区之间空间构型的互补性。交叉反应交叉反应（cross reactioncross reaction）性：若两种抗原）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。反应。 结合价：结合价： 天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与天然抗原分子表面一般含多

3、种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为多个抗体分子结合，为多价多价。单体形式的抗体分。单体形式的抗体分子有两个子有两个FabFab段，能结合两个相同的抗原决定基，段，能结合两个相同的抗原决定基，为为两价两价。2.2.比例性比例性比例合适：比例合适： 若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个FabFab段段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成网格状复合网格状复合体体，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。成肉眼可见的

4、反应物（沉淀物或凝集物）。 因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。前带现象（前带现象（prozone）和后带现象）和后带现象(postzone) v Ab过剩和过剩和Ag过剩过剩前带现象（前带现象（prozoneprozone）和后带现象）和后带现象(postzone(postzone) )AbAb过剩和过剩和AgAg过剩过剩网格学说网格学说（lattice theory）抗体过剩抗体过剩抗原过剩抗原过剩抗体抗体比例合适抗体抗体比例合适抗原抗原抗体抗体 抗原抗原- -抗体反应为分子表面的非共价结合，结抗体反应为分子表面的非共价结合，

5、结合合虽稳定但可逆虽稳定但可逆。在一定条件下（如低。在一定条件下（如低pHpH、高浓、高浓度盐、冻融等），抗原度盐、冻融等），抗原- -抗体复合物可被解离。抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。学活性。 根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。体。3.3.可逆性可逆性4.4.阶段性阶段性 抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原- -抗抗体复合物失去电荷而凝聚，出

6、现可见反应，故体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中免疫学试验中多用生理盐水稀释抗原或抗体多用生理盐水稀释抗原或抗体。 抗原抗体反应的最适抗原抗体反应的最适pHpH是是6-86-8。最适温度为最适温度为3737。有些例外，如冷凝集素在。有些例外，如冷凝集素在 44左右与红细胞结合最好，左右与红细胞结合最好，2020以上反而以上反而解离。解离。 抗体的特异性和亲和力是决定抗原抗体的特异性和亲和力是决定抗原- -抗体抗体反应的关键因素。反应的关键因素。 此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原种类等均可影响抗原- -抗体反应。抗体反应

7、。抗体分子上一个抗抗体分子上一个抗原结合点与对应的原结合点与对应的抗原决定基之间的抗原决定基之间的结合能力结合能力亲和力亲和力( (affinity) 根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：应的成分等因素分类： 1.凝集反应凝集反应 2.沉淀反应沉淀反应 3.补体参加的反应补体参加的反应 4.中和反应中和反应 5.免疫标记技术免疫标记技术 反应类型反应类型实验技术实验技术非非标标记记凝集反应凝集反应直接凝集试验、间接凝集试验、间接直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应沉淀反应液相内凝

8、集试验、凝胶内凝集试验液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应补体参与的反应补体溶血试验、补体结合试验补体溶血试验、补体结合试验中和反应中和反应病毒中和试验、毒素中和试验病毒中和试验、毒素中和试验标标记记标记免疫反应标记免疫反应荧光免疫技术荧光免疫技术放射免疫技术放射免疫技术酶免疫技术酶免疫技术发光免疫技术发光免疫技术金免疫技术金免疫技术 颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应集反应(agglutination)(agglutination) 。用于凝集反

9、应中的抗原称用于凝集反应中的抗原称凝集原凝集原(agglutinogen(agglutinogen) )。用于凝集反应中的抗体称用于凝集反应中的抗体称凝集素（凝集素（agglutinin)agglutinin)。 凝集反应（凝集反应（Agglutination TestsAgglutination Tests）直接凝集（直接凝集（direct agglutination) ： 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。细菌或红细胞凝集现象。2 2间接凝集间接凝集（indirect or passive agglutination) ： 检

10、测针对可溶性检测针对可溶性AgAg的的AbAb3 3间接凝集抑制试验间接凝集抑制试验 (direct agglutination inhibition test)4. 4. 协同凝集试验协同凝集试验（co-agglutination test）妊娠免疫诊断试验妊娠免疫诊断试验 v孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（HCGHCG）含量明显增）含量明显增高。（高。（HCGHCG是可溶性抗原是可溶性抗原 ）v反之，非孕妇尿中反之，非孕妇尿中HCGHCG含量甚微，不足以消耗掉抗含量甚微，不足以消耗掉抗HCGHCG抗体。抗体。 Definition:Definition:可溶性抗原可

11、溶性抗原（血清蛋白、外毒素、（血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应（沉淀反应（Precipitation Tests） 用于沉淀反应中的抗原称用于沉淀反应中的抗原称沉淀原沉淀原(precipitonogen(precipitonogen) )。用于沉淀反应中的抗体称用于沉淀反应中的抗体称沉淀素沉淀素（precipitin) precipitin) 。 v大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质大多沉淀反应多用半固体琼脂凝胶作为介质进行进

12、行琼脂扩散琼脂扩散或或免疫扩散免疫扩散，即可溶性抗原与，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。成可见的白色沉淀。1 1单向免疫扩散单向免疫扩散(single immunodiffusion(single immunodiffusion) )2 2双向免疫扩散双向免疫扩散(double immunodiffusion(double immunodiffusion) )3 3免疫电泳免疫电泳(immunoelectrophoresis(immunoelectrophoresis) )4 4免疫比浊免疫比浊(immunonephe

13、lometry(immunonephelometry) ) 沉淀反应沉淀反应单向免疫扩散单向免疫扩散(Single Immunodiffusion(Single Immunodiffusion) )v是将一定量已知抗体混于是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心遇，形成以抗原孔为中心的的沉淀环沉淀环，环的直径与抗，环的直径与抗原含量成正比相关。本法原含量成正比相关。本法常用于测定血清常用于测定血清IgGIgG、IgM

14、IgM、IgAIgA 和和 C C 3 3等的含量。等的含量。含抗体的凝胶含抗体的凝胶沉淀环沉淀环双向免疫扩散双向免疫扩散 （Double ImmunodiffusionDouble Immunodiffusion) )v是将抗原与抗体分别加入是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成在比例合适处形成沉淀线沉淀线。如果反应体系中含两种以如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或淀线。本法常用于抗原或抗体的定性抗体的定性 、

15、组成和两、组成和两种抗原相关性分析的检测。种抗原相关性分析的检测。免疫电泳免疫电泳（ImmunoelectrophoresisImmunoelectrophoresis) ) 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 两大优点：一是加快了沉淀反应的速度，两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而 将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。将其分开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括免疫电泳包括: :血清免疫电泳、对流免疫电泳、火箭电泳、血清免疫电泳、对

16、流免疫电泳、火箭电泳、免疫印迹等免疫印迹等免疫电泳免疫电泳（ImmunoelectrophoresisImmunoelectrophoresis) )v是先将待侧血清标本作琼是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察种类分析，以观察IgIg的异

17、的异常增多或缺失。常增多或缺失。免疫电泳原理图解免疫电泳原理图解火箭电泳火箭电泳（Rocket Electrophoresis)Rocket Electrophoresis) 补体结合试验补体结合试验（Complement Fixation test, CFT)Complement Fixation test, CFT)补体结合试验补体结合试验(complement fixation test，CFT ) 将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应应 系统中抗原或抗体的传统方法。系统中抗原或抗体的传统方法。试验原理试验原理作用原理：作用原理：利用补体的溶细胞

18、作用进行各种利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定物理状态的抗原抗体测定5种成分，种成分，3个系统个系统 反应系统（溶菌系统）：反应系统（溶菌系统）：已知已知抗原抗原（或抗体）（或抗体） 与待测与待测抗体抗体（或抗原）（或抗原） 补体补体系统：系统： 指示系统（溶血系统）：指示系统（溶血系统）：SRBC与相应与相应溶血素溶血素。试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞试验时常将其预先结合，成为致敏绵羊红细胞（sensitized sheep red blood cell,SRBCS）。溶溶菌菌系系统统反应分两步进行反应分两步进行 第一步第一步: :反应系统与补体的作用反应系统与补体

19、的作用 第二步第二步: :指示系统利用剩余补体的反应指示系统利用剩余补体的反应不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性不溶血为补体结合试验阳性，而溶血为试验阴性已知抗原加入血清（检测抗体）已知抗原加入血清（检测抗体）加入标准量补体加入标准量补体加入包被抗体的红细胞加入包被抗体的红细胞检测红细胞溶解情况检测红细胞溶解情况AgPatientsserum AbNo AbAg 用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原标记抗体或抗原，进行抗原- -抗体反应的检测，是抗体反应的检测，是目前应用最为广泛的免疫学检测技术。标记物与目前应用最为广

20、泛的免疫学检测技术。标记物与抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，抗体或抗原连接后并不改变抗原抗体的免疫特性，具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优具有灵敏度高、快速、可定性、定量、定位等优点。点。免疫标记技术免疫标记技术（ImmunolabellingImmunolabelling technique technique） 用荧光素与抗体连接成用荧光素与抗体连接成荧光抗体荧光抗体，再与待，再与待检标本中抗原反应，置检标本中抗原反应，置荧光显微镜荧光显微镜下观察，抗下观察，抗原原- -抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位。性或定位。 1免疫

21、荧光法免疫荧光法(immunofluorescence, IF)（1 1）直接荧光法：）直接荧光法：荧光素直接标记抗体，对标本荧光素直接标记抗体，对标本进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任进行检测。该法优点是特异性高，缺点是检查任一抗原均须制备相应荧光抗体。一抗原均须制备相应荧光抗体。（2 2）间接荧光法：）间接荧光法：用一抗与标本中抗原结合，再用一抗与标本中抗原结合，再用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感用荧光素标记的二抗进行检测。该法优点是敏感度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可度比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗即可用于多种抗原的检测用于多种抗原的检测, ,但非特异性

22、反应亦增强。但非特异性反应亦增强。免疫荧光法分类免疫荧光法分类免疫荧光法图示免疫荧光法图示 此法将抗原此法将抗原- -抗体反应的特异性与抗体反应的特异性与酶催化作用酶催化作用的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应的高效性相结合，借助酶作用于底物的显色反应判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（判定结果。应用酶标测定仪测定光密度（ODOD）值）值可反映抗原含量，灵敏度达可反映抗原含量，灵敏度达ngng/ml/ml甚至甚至pg/mlpg/ml水平。水平。常见的标记物为：辣根过氧化物酶（常见的标记物为：辣根过氧化物酶（HRPHRP）和碱）和碱性磷酸酶（性磷酸酶（APAP） 酶免疫测定酶免疫测定(en

23、zyme immunoassay, EIA)常用的方法如下：常用的方法如下：（1 1）酶联免疫吸附试验）酶联免疫吸附试验 (enzyme linked (enzyme linked immunosorbentimmunosorbent assay assay，ELISA) ELISA) （2 2）免疫细胞或组织化学）免疫细胞或组织化学（immunocytochemistry or immunocytochemistry or immunohistochemistry,ICCimmunohistochemistry,ICC or IHC) or IHC)是酶免疫测定中应用最广的技术，用于是酶免疫

24、测定中应用最广的技术，用于测定测定可溶性抗原或抗体。可溶性抗原或抗体。优点：灵优点：灵敏度高、操作简便、稳定性强，可敏度高、操作简便、稳定性强，可自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原自动化检测，从而被广泛用于检测多种病原体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白体抗原或抗体、血液及其他体液中微量蛋白成分、细胞因子等。成分、细胞因子等。双抗体夹心法：双抗体夹心法：用于检测特异性抗原用于检测特异性抗原。该试验所用的包被抗体与酶。该试验所用的包被抗体与酶标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用标抗体应分别针对不同抗原决定基，或其中之一用多克隆抗体，且相互间应无交叉反应。多克隆抗体，且相互间应无交叉

25、反应。间接法：间接法：用于检测特异性抗体用于检测特异性抗体。用已知抗原包被固相，加入。用已知抗原包被固相，加入待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显待检血清标本，再加酶标记的二抗，加底物观察显色反应。色反应。 应用应用酶标记酶标记的抗体与的抗体与组织或细胞抗原组织或细胞抗原发生反发生反应，应，结合形态学观察结合形态学观察，对组织或细胞表面抗原，对组织或细胞表面抗原进行定性、定量、定位。进行定性、定量、定位。ICCIHC 乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学乃用放射性核素标记抗原或抗体进行免疫学检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原检测。该法兼有放射性核素的高灵敏度和抗原- -抗体反应

26、的特异性，检测灵敏度达抗体反应的特异性，检测灵敏度达pgpg水平。常用水平。常用于标记的放射性核素为于标记的放射性核素为125125I I和和131131I I，分为液相和固，分为液相和固相两种方法。相两种方法。 该法常用于测定该法常用于测定微量物质微量物质，如胰岛素、生长，如胰岛素、生长激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、激素、甲状腺素、孕酮等激素，吗啡、地高辛、IgEIgE等。等。 3放射免疫测定法放射免疫测定法(radioimmunoassay, RIA)化学发光免疫分析化学发光免疫分析 将将发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记发光物质（如吖啶酯、鲁米诺等）标记抗抗原或抗体，发光物质

27、在反应剂（如过氧化阴离子原或抗体，发光物质在反应剂（如过氧化阴离子）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光）激发下发射光子，通过自动发光分析仪测定光子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。子产量，可反映待检样品中抗体或抗原含量。 该法灵敏度高，常用于检测该法灵敏度高，常用于检测血清超微量血清超微量活性活性物质（甲状腺素等激素）。物质（甲状腺素等激素）。 该法又称该法又称WesternWestern印迹法，其结合凝胶电印迹法，其结合凝胶电泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋泳与固相免疫技术，将借助电泳所区分的蛋白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射白质转移至固相载体，再应用酶免疫、放射免疫等

28、技术进行检测。免疫等技术进行检测。 该法能对分子大小不同的蛋白质进行分该法能对分子大小不同的蛋白质进行分离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗离并确定其分子量，常用于检测多种病毒抗体或抗原。体或抗原。免疫印迹法免疫印迹法(immunoblotting)v原理：原理：病毒、细菌、毒素与相应抗体特异结病毒、细菌、毒素与相应抗体特异结合后，丧失生物活性。合后，丧失生物活性。v用途：用途：1. 1. 用已知血清鉴定病毒、细菌、毒素、兽药残用已知血清鉴定病毒、细菌、毒素、兽药残留等。留等。2. 2. 用已知病毒、细菌检测血清抗体用已知病毒、细菌检测血清抗体测定抗测定抗体免疫血清效价（中和价）。体免疫血清

29、效价（中和价）。中和试验（病毒、毒素）中和试验（病毒、毒素）二、免疫细胞的检测二、免疫细胞的检测v 检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。察机体免疫状态的重要手段。v外周血是病人主要的检测标本，但仅代外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。（一）淋巴细胞及亚群的分离（一）淋巴细胞及亚群的分离外周血单个核细胞外周血单个核细胞(PBMC)的分离：的分离：葡聚糖泛影葡胺（即葡聚糖泛影葡胺（即淋淋巴细胞分离液巴细胞

30、分离液）密度梯度离心密度梯度离心法法包含淋巴细胞、单核细胞树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。包含淋巴细胞、单核细胞树突状细胞和其它少量细胞（造血干细胞等）。 密度梯度离心法密度梯度离心法原理：原理：外周血各种血细胞的外周血各种血细胞的密度密度不尽相同，利用不尽相同，利用淋巴细胞分层液（淋巴细胞分层液（FicollFicoll）作密度梯度离心，作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从，从而将各种血细胞加以分离。而将各种血细胞加以分离。 为此利用一种密度介于为此利用一种密度介于1.0751.0751.0921.092之间而之间而近于近于等

31、渗等渗的溶液（分层液）做的溶液（分层液）做密度梯度离心密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。将各种血细胞加以分离。 常用的分层液有常用的分层液有FicollFicoll和和PercollPercoll两种。两种。(1) 抗凝抗凝静脉血静脉血(2) 加等加等量量NS(4) 密度梯度离心密度梯度离心血浆血浆分离液分离液RBCPBMCPMN(3) 混匀后，缓混匀后，缓慢加于分离液上慢加于分离液上外周血外周血红细胞红细胞粒细胞粒细胞单个核细胞单个核细胞血小板血小板淋巴细胞淋巴细胞单核细胞单核细胞1.0931.0301.035

32、1.0751.090Ficoll：1.0770.001 1.092 密密 度度 分分 类类 （PBMC） 淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及淋巴细胞为不均一的群体，可借助其表面标志及功能差异而分为不同的群和亚群。功能差异而分为不同的群和亚群。 1 1尼龙棉分离法尼龙棉分离法 2 2E E花环分离法花环分离法 3 3洗淘法洗淘法 4 4流式细胞术流式细胞术(flow cytometry(flow cytometry，FCM) FCM) 5 5磁珠分离技术磁珠分离技术(1)E(1)E花环分离法花环分离法原理：人类原理：人类T T细胞表面细胞表面上有能与上有能与绵羊红细绵羊红细胞相结合的受体

33、胞相结合的受体（E E受体，受体，CD2CD2）, ,能与经能与经溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（溴化二氨基异硫基异硫脲氰化物（AETAET）处理的绵羊红细胞结合，形成处理的绵羊红细胞结合，形成稳定的稳定的、细胞体积和比重较大细胞体积和比重较大的的E E花环。花环。v方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞+SRBC+SRBC悬液悬液加入分层液加入分层液T T细胞细胞形成形成E E花环而花环而沉于管底沉于管底悬液中悬液中为为B B细胞。细胞。E花环花环E花环实验花环实验（2 2）尼龙纤维分离法）尼龙纤维分离法v原理：原理：B B细胞细胞在在3737时易时易粘附于尼龙粘附于尼龙棉（聚酰胺）纤维棉（聚酰胺）纤维

34、上，而上，而T T细胞不具细胞不具此能力。此能力。v方法：淋巴细胞方法：淋巴细胞通过聚酰胺纤维通过聚酰胺纤维管管洗脱下来的是洗脱下来的是T T细胞。细胞。（3 3）流式细胞术）流式细胞术v又叫荧光激活细胞分离仪又叫荧光激活细胞分离仪 (nuorescence(nuorescence activated cell sorteractivated cell sorter, , FACS FACS ) )法法原理：原理： 细胞经细胞经荧光染色荧光染色后，通过后，通过高速流动高速流动系统系统，细胞排成，细胞排成单行单行，逐个流经检测区，逐个流经检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴处流出进行测定。当细胞从

35、流动室喷嘴处流出时，超声振荡动液流，使液流断裂成一时，超声振荡动液流，使液流断裂成一连串的均匀小滴连串的均匀小滴(4000(4000个个/s)/s)，每小滴内每小滴内最多含一个细胞最多含一个细胞，细胞经激光束照射产，细胞经激光束照射产生荧光和散射光，由光电倍增管接收，生荧光和散射光，由光电倍增管接收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分转换成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨细胞的类型。辨细胞的类型。激发系统激发系统细胞分选系统细胞分选系统荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 检测与讯号处理系统检测与讯号处理系统细胞流动系统及气压流速控制系统细胞流动系统及气压流速控制系统流式细胞分析仪流

36、式细胞分析仪v通过流式细胞仪检测：通过流式细胞仪检测：检测检测T T细胞总数细胞总数: : 抗抗CD3 CD3 检测检测CD4+/ CD8+TCD4+/ CD8+T细胞细胞: : 抗抗CD4/CD8CD4/CD8检测检测B B细胞细胞: : 抗抗SmIgSmIg（4 4）磁珠分离术）磁珠分离术v磁珠分离术是将磁性材料颗粒表面进行外理，磁珠分离术是将磁性材料颗粒表面进行外理，微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子材料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质（抗原、抗体、核酸等），物质（抗原、抗体、核酸等），若微球表

37、面包若微球表面包被有免疫物质则称为免疫磁珠被有免疫物质则称为免疫磁珠，其兼有免疫配，其兼有免疫配基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，基的性质和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场时磁性消除。移出磁场时磁性消除。 目前商品出售的磁珠有直径为目前商品出售的磁珠有直径为1 15um5um等等不同的规格，表面活性基团有氨基（不同的规格，表面活性基团有氨基（NH2NH2）、）、羧基（羧基（COOHCOOH）和羟基（）和羟基（OHOH）等。）等。包被的免疫物质有：一抗、二抗等。包被的免疫物质有：一抗、二抗等。v方法：方法： 将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞将包被有关抗体的磁珠与待分离细胞充分作用

38、，这样借助于抗体磁珠，将与充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与相应的细胞结合成：相应的细胞结合成：细胞抗体磁珠细胞抗体磁珠复合物复合物，该细胞在磁场中运动与其他细，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明显差别。胞产生明显差别。 如采用层析的方法，将层析柱如采用层析的方法，将层析柱放于强放于强磁场中磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限，与磁珠结合的细胞运动将受限，而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来。来。再将该柱再将该柱移出磁场移出磁场，与磁珠结合的细，与磁珠结合的细胞也将被洗脱下来，达到分离目的。胞也将被洗脱下来，达到分离目的。单克隆抗体单克隆抗体CD3羊抗鼠修羊抗鼠

39、修饰磁球饰磁球Biomag抗抗CD3磁球磁球磁球结合磁球结合T细胞细胞加入加入B和和T细胞中细胞中负向选择负向选择正向选择正向选择磁架进行分离磁架进行分离直接法对细胞进行分类直接法对细胞进行分类间接法对间接法对T细胞进行分离细胞进行分离免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置（5 5）亲和板结合分离法）亲和板结合分离法原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗性。原理：各种淋巴细胞亚群具有不同的抗性。 分离分离CD4CD4+ +或或CD8CD8+ +细胞，可用抗细胞，可用抗CD4CD4或或CD8CD8单克隆抗体吸附。单克隆抗体吸附。 分离分离B B细胞用抗细

40、胞用抗IgIg抗体。抗体。 分离有分离有C3C3受体的细胞用活化的受体的细胞用活化的C3C3包被。包被。将相应抗体结合将相应抗体结合于塑料平板上于塑料平板上抗原阳性的细胞抗原阳性的细胞与相应抗体结合与相应抗体结合二、免疫细胞功能的测定二、免疫细胞功能的测定 （一）（一） T T细胞功能测定：细胞功能测定：1. 1. 细胞增殖细胞增殖( (转化转化) )试验：试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。 * 丝裂原主要有丝裂原主要有PHA、Con A和和PWM； * 抗原刺激物有破伤风类毒素、抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念和白色念珠菌等；珠菌等；淋

41、淋巴巴细细胞胞增增殖殖实实验验淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验（形态学示意图形态学示意图）v原理：人原理：人T T细胞表面有细胞表面有PHAPHA或或ConAConA受体，受体，T T细胞在体细胞在体外受外受PHAPHA或或ConAConA的刺激后能转化为体积较大、代谢的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T T细胞细胞的功能。的功能。 PHA刺激48-72小时淋巴细胞增殖淋巴细胞增殖3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法v原理：将单个核细胞中加入原理：将单个核细胞中加入PHAPHA共同培养，在终止共同培养，在终止培养前培养前

42、815815小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（3 3H-H-TdR), TdR), 经经-液体闪烁仪检测淋巴细胞液体闪烁仪检测淋巴细胞DNADNA的的3 3H-TdRH-TdR掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。MTT(MTT(四甲基偶氮唑盐）法四甲基偶氮唑盐）法v原理：在细胞培养终止前数小时加入原理：在细胞培养终止前数小时加入MTTMTT，活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解MTTMTT产生产生蓝色甲攒（蓝色甲攒（FormazanFormazan) )沉积于细胞内或细胞沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖

43、程度成正相周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。关。CTLTcTc和和NKNK对其靶细胞有直接的细胞毒作用。对其靶细胞有直接的细胞毒作用。方法：方法：51Cr(51Cr(铬铬) )释放法释放法 乳酸脱氢酶释放法乳酸脱氢酶释放法 凋亡细胞检测法凋亡细胞检测法(1) B(1) B细胞增殖细胞增殖( (转化转化) )试验试验 (2) (2) 溶血空斑形成试验溶血空斑形成试验 (3) (3) 酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法( (ELISPOT):ELISPOT): （二）（二） B B细胞功能测定细胞功能测定v1. B1. B细胞增殖试验细胞增殖试验 B B细胞受有丝分裂原刺激后分裂增殖，温育一定细

44、胞受有丝分裂原刺激后分裂增殖，温育一定时间后检查抗体形成细胞的数目。时间后检查抗体形成细胞的数目。小鼠小鼠B B细胞可用细菌脂多糖为刺激物，人细胞可用细菌脂多糖为刺激物，人B B细胞则细胞则用含有金黄色葡萄球菌蛋白用含有金黄色葡萄球菌蛋白A A（SPASPA）的金黄色葡）的金黄色葡萄球菌菌体及抗萄球菌菌体及抗IgMIgM抗体刺激。抗体刺激。v2. 2. 抗体形成细胞测定抗体形成细胞测定 常用溶血空斑试验常用溶血空斑试验(hemolytic plaque assay)(hemolytic plaque assay)，即测定，即测定针对针对SRBCSRBC表面已知抗原的抗体形成细胞数目。表面已知抗原的抗体形