白藜芦醇苷四种异构体

1、高效液相色谱法检测白藜芦醇及其糖甘四种异构体曾玮马志玲中山大学化学与化学工程学院，分析科学研究所广州510275摘要本实验建立了 RP-HPL C法同时分离测定白藜芦醇及其糖甘四种异构体的 方法，将方法用于红葡萄酒中白藜芦醇及其糖甘的四种异构体、虎杖中反式白藜芦醇及其糖甘的分析测定获得满意的结果。以Hypersil ODS2 （ 5叩1I.D. 4.0mm x 200mm色谱柱，用甲醇，水作为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器在306nm（反式白藜芦醇及甘），288nm（顺式白藜芦醇及甘）检测，白藜芦醇及其糖甘的四种异 构体在30min内得到较好的分离。确定了提取红葡萄酒中白藜芦醇及其糖甘的

2、 四种异构体的最佳预处理方法，在pH=2的条件下，以乙酸乙酯为溶剂可获得最佳萃取效果，此方法用于5种不同的红葡萄酒中，白藜芦醇及其糖甘的回收率分别为94.6%、97.8%。使用微波破壁-溶剂提取-高效液相色谱法测定虎杖中的 反式白藜芦醇及其糖甘，大大简化了分析步骤。关键词 高效液相色谱法，葡萄酒，虎杖1.前言白藜芦醇（Resveratrol）是植物体内产生的天然二苯乙烯类多酚物质，一种天然活性成分。糖甘可以分解为白藜芦醇。白藜芦醇及糖甘，存（trans-resveratrol），顺式白藜芦醇（cis-在自然条件下，白藜芦醇主要以其糖甘的形式存在，分子中，其连续环状分子中的双键能够在紫外光或其它

3、物理化学因素的诱导下发生几何异构在白藜芦醇及其糖甘的4种异构体，即反式白藜芦醇glucoside）和顺式白藜芦醇-3-O"糖甘resveratrol），反式白藜芦醇-3-O- p 糖甘（trans-resveratrol98-3-O- 3糖昔HO反式白藜芦醇-3-O- 6糖甘顺式白藜芦醇图1白藜芦醇及其甘的异构体化学结构图*基金项目 中山大学化学与化学工程学院第三届创新化学实验与研究项目（批准号02018）第一作者 曾玮 （1981年1月出生） 女 中山大学化学与化学工程学院材料化学系 99级指导老师 马志玲Email地址cesmzl白藜芦醇及白藜芦醇甘具有抗癌、预防动脉粥样硬化、抗

4、细菌、抗真菌、抗休克、镇咳平喘等多种药理作用。可以使用气相色谱、毛细管电泳法2和高效液相色谱35对其进行分离测定。本文采用高效液相色谱法分别对葡萄酒和中草药虎杖中白藜芦醇及其糖甘进行分析。本实验以葡萄酒作为研究对象，在比较固相萃取法和液液萃取法的萃取效率的基础上，提出了乙酸乙酯作为萃取剂的液液萃取法同时萃取红葡萄酒中白藜芦醇及其甘的四种异构体是最好的前处理方法，优化了乙酸乙酯萃取红葡萄酒中白藜芦醇及其甘的四种异构体的最佳条件，使用液液萃取法一HPLC法对5种红葡萄酒中白藜芦醇及其甘的四种异构体进行了分离测定。本文还采用微波破壁一溶剂提取一HPLC法直接测定虎杖中白藜芦醇及其糖甘反式白藜芦醇及其

5、糖甘，与传统的溶剂浸取方法相比较，大大简化了分析步骤，获得满意的结果。2.实验部分2.1仪器配有二极管阵列检测器的1100型高效液相色谱仪（Agilent公司），化学工作站（AgilentChemStation for LC 3D ）, QW-2HC©多管微波机（箱式）,ZF-3型三用紫外仪，旋转蒸发仪。2.2试剂反式白藜芦醇纯品（经HPLC检验纯度99.99% , Sigma公司）；反式白藜芦醇甘纯品（经HPLC检验纯度99.9%，北京迪尔塔金生物有限公司） ；顺式白藜芦醇及其糖甘的标准品由经紫 外光照射其相应的反式化合物获得。甲醇（ HPLC级，MTEDLA ）,流动相所用水为双

6、蒸水； 其余试剂均为分析纯。2.3色谱条件色谱柱（依利特公司）Hypersil ODS2（5Mm I.D. 4.0mm x 200mm ），并配有 C18保护柱；流动相为 MeOH和H2O,采用下列梯度淋洗方式分别分离测定红葡萄酒和虎杖中白藜芦醇及其 糖甘的4种异构体，（1）红葡萄酒的梯度洗脱程序：015min 10%22%、1525min 22%50%、2534min 50%66% （ MeOH 浓度，v/v） , （2）虎杖的梯度洗脱程序：020min 20%60%、2030min 60%100% （ MeOH 浓度，v/v）；柱温30 C； 流速0.8mL/min ;检测波长分别为 28

7、8nm（顺式白藜芦醇和甘）、306nm （反式白藜芦醇和甘）；进样量：10卜L。在上述色谱条件下，白 藜芦醇及其糖甘的 4种异构体的色谱分离图如图2。图2梯度B分离白藜芦醇及其昔四种异构体的色谱图梯度A分离白藜芦醇及其昔四种异构体的色谱图A反式白藜芦醇昔，B反式白藜芦醇，C顺式白藜芦醇昔 ，D顺式白藜芦醇；色谱条 件如正文。2.4实验万法1 .红葡萄酒中白藜芦醇及其糖甘的4种异构体的分离测定取适量市售红葡萄酒，用 2mol/L的HCl调其pH值至2,准确移取上述红葡萄酒于分液漏 斗中，用三倍于试样体积的乙酸乙酯分三次萃取，每次萃取时间为10min,分出有机层，合并有机层用旋转蒸发仪低温旋干，加

8、50%甲醇水溶液溶解，使用0.45Mm滤膜过滤，滤液按上述色谱条件分析检测，用外标法、峰面积进行定量。2.虎杖中反式白藜芦醇及其糖甘的2种异构体的分离测定称取适量虎杖样品，适量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波辐照，无水乙醇，水浴加热 回流。向提取液加入适量的HCl，继续加热回流。 处理后的提取液旋转蒸发，定容，使用0.45丽滤膜过滤，滤液按上述色谱条件分析检测，用外标法、峰面积进行定量。3.结果与讨论3.1色谱梯度洗脱条件优化通过尝试不同的梯度淋洗，对四种异构体的混合标准样品、红葡萄酒实际样品和虎杖实际样品进行分离分析，从分离度、峰形、实际试样的背景及分析时间等多因素考虑，最终确定分离红葡萄

9、酒和虎杖的梯度洗脱程序分别为A和B。A : 015min 10%22%、1525min 22%50%、2534min 50%66% ; B : 020min 20%60%、2030min 60%100% （ MeOH 浓度，v/v）; 使用最佳色谱条件对红葡萄酒和虎杖的色谱分离图如图3, 4所示。那201510DADI:/非苔:消彻'二点'：；.三三I： flnl_图3用梯度A分离红酒实际样品色谱图A反式白藜芦醇昔， B反式白藜芦醇， C一 一顺式白藜芦醇昔 D顺式白藜芦醇；色谱条 件如正文。I II"'：10:2025 T-图4 用梯度B分离虎杖实际样品色谱

10、图A反式白藜芦醇昔，B反式白藜芦醇，色谱分离条件如正文乙醍液液萃取与5。实验表明对于红酒中四种异构体液液萃取明显优于固相萃取3.2红酒预处理条件优化1.液液萃取和固相萃取C18固相萃取柱固相萃取处理红葡萄酒,以红葡萄酒为研究对象， 使用乙酸乙酯、 实验结果如图2.液液萃取条件优化以红葡萄酒为研究对象，分别采用乙酸乙酯、乙醍，石油醍为萃取溶剂，按实验方法进行图5固相萃取法与液液萃取法研究波尔多红酒中白 藜芦醇及昔的四种异构体萃取效率图6不同萃取剂对波尔多红酒中白藜芦醇及其糖昔 四种异构体萃取效率的影响trans-res-glu trans-res cis-res-glu cis-res石油醍PH

11、2 PH3 PH5 PH7 PH9图7 pH值对波尔多红酒中四种异构体萃取效率的影响本实验对以乙酸乙酯为萃取剂进行液液萃取时pH值进行优化。实验结果如图7 o实验表明， 随pH值的变化，除了顺式白藜芦醇外，其余三 种异构体的提取率都减少，本实验选择pH=2为最佳萃取酸度。3.3虎杖的预处理条件优化本文采用正交设计法对微波破壁-溶剂提取的方法进行优化，最终确定了虎杖预处理的最佳 条件。3.4线性范围、标准曲线及最小检出量在选定的最佳测定条件下，按实验方法进行实验，反式白藜芦醇及其糖甘、顺式白藜芦醇及其糖甘的峰面积与其含量分别在11110mg/ml , 47.2 472mg/ml , 9.599m

12、g/ml , 32.1192.8mg/ml 范围里成线性关系；其标准曲线分别为 A = 67.1364032 x C - 27.15776、R= 0.99924 , A=48.5681839x C -299.04331、R= 0.9999 , A=37.5594047 x C-76.61838、R=0.99430 , A=20.7779987 x C+158.5657、R=0.99413。在选定的最佳测定条件下，取适量红葡萄酒，按实验方法操作，以峰面积定量，平行测定五次，求其标准偏差，标准偏差的 3倍即为方法最小检出量。其分别为1.02Mg/ml、0.7Mg/ml、1.04Mg/ml、0.45

13、 Mg/ml。3.5回收率实验准确吸取 20.00mL12%的乙醇水溶液，分别准确加入 1.00 mL 42.0 Mg/ml、48.6g/ml反式白藜户醇在，反式白藜户醇的标样，按实验方法进行实验，以峰面积定量，测得反式白藜户醇及其糖甘的回收率分别为 94.6%、97.8%。3.6红葡萄酒中白藜芦醇及其糖昔的四种异构体测定取适量市售不同品牌的红葡萄酒，用2mol/L的HCl调其pH值至2,准确吸取上述试液20.00mL按实验方法进行实验。实验结果如表1 o从表中数据看来，红酒中白藜芦醇甘的含量比白藜芦醇的含量高，反式白藜芦醇及甘的含量比其对应的顺式异构体含量高。表1五种不同红酒中白藜芦醇及甘四

14、种异构体的含量白藜芦醇甘白藜芦醇牌子A(十/ml)B (电/ml)合计（电/ml）C (Jg/ml)D (十/ml)合计(Jg/ml)总计(Jg/ml)梅洛红红酒（20007.49.717.16.32.79.026.1年）梅洛红红酒（20015.72.48.13.32.76.014.1年）女士红红酒1.60.211.810.0950.290.3852.20新天玛纳斯干红1.30.832.130.680.681.363.49波尔多红酒0.940.861.800.600.431.042.84A反式白藜芦醇甘，B顺式白藜芦醇甘，C反式白藜芦醇，D顺式白藜芦醇3.7中草药虎杖中反式白藜芦醇及其糖昔的测

15、定准确称取20g虎杖试样，适量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波辐照，无水乙醇，水浴 加热回流，定容，使用0.45收 滤膜过滤，滤液按上述色谱条件分析检测，以峰面积定量测定反式白藜芦醇的含量。另准确称取20g虎杖试样，适量水浸泡，除去水分，以一定功率的微波辐照， 无水乙醇，水浴加热回流。向提取液加入适量的HCl ,继续加热回流。处理后的提取液旋转蒸发，定容，使用 0.45Mm滤膜过滤，滤液按上述色谱条件分析检测，以峰面积定量测定反式白藜 芦醇的含量。水解前中草药中反式白藜芦醇甘的含量为0.65%，反式白藜芦醇的含量为0.12%,水解后反式白藜芦醇的含量为0.78%。D峋A SNI.M也枷疝W那

16、徵垃 的|图8未水解的，其余步骤按 2. 5. 1进行的虎杖提取液 在盐酸浓度5%温度90C水浴加热回流 1h 的水解条件下水解后的虎杖提取液色谱图A反式白藜芦醇昔 ，B反式白藜芦醇，C顺式白藜芦醇昔 ，D顺式白藜芦醇；色谱条件如正文。本实验对微波破壁后醇提与传统提取方法进行比较。传统醇提方法是直接用乙醇提取目标物。不经微波破壁，直接以水浴加热，无水乙醇回流1h,提取虎杖中白藜芦醇，其余按实验方法进行，得到白藜芦醇的提取率为0.27%，是微波破壁后醇提得到的产率的约1/3。证明经过微波破壁，可以明显改善随后的溶剂提取的效果。参考文献1马亭，李攻科，李晓东等.葡萄酒中白藜芦醇的固相萃 GCM皴测

17、定及其生理活性的初步研究取.高等学校化学学报.2 000, 25 (7): 10232郑妍鹏，李晓东，莫金垣等.非水介质毛细管电泳电导检测虎杖中的白藜芦醇.应用化学.2 002 ,19 (6): 5853戴蕴青，陈雷，韩雅珊等.红葡萄酒中白藜芦醇及其糖昔异构体的反相hplc分析.中国农业大学学报.2 002 , 7 (1)：144 Malovana S. , Montelongo G. , Perez J.P. , etc. Optimisation of sample preparation for the determination oftrans-resveratrol and othe

18、r polyphenolic compounds in wines by high performance liquid chromatographyJ. Anal.Chim.Acta . 2 001,428: 2455 Dominguez C. , Guillen D.A. , Barroso C.G. , Automated solid-phase extraction for sample preparation followed byhigh-performance liquid chromatography with diode array and mass spectrometri

19、c detection for the analysis of resveratrol derivatives in wine. J.Chromatogr. A. 2 001, 918： 303致谢本文在导师马志玲副教授的指导下完成，并得到吴京洪老师、邹世春副教授的大力支持，00级研究生欧阳姗的热心帮助，特此表示衷心感谢。Determination of isomers of resveratrol and its glucosides by HPLCZeng Wei Ma Zhi Ling*(School of Chemistry and Chemical Engineering, Sun

20、yat-sen University, GZ 510275)Abstract The method for simultaneity determination the isomers of resveratrol and its glucoside with reversed-phase high performance liquid chromatography was studied using Hypersil ODS2 (5 硕 I.D. 4.0mm x 200mm) column, methanol/water as mobile phase for gradient elution, the photodiode array detector at 306nm for trans- resveratrol and glucoside, 288nm for cis- resveratrol and glucoside .A v