琼脂糖凝胶电泳完整整理PPT学习教案

1、会计学1琼脂糖凝胶电泳完整整理琼脂糖凝胶电泳完整整理第1页/共31页第2页/共31页第3页/共31页琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳第4页/共31页第5页/共31页量的DNA ，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA 分子。第6页/共31页第7页/共31页第8页/共31页第9页/共31页第10页/共31页第11页/共31页第12页/共31页第13页/共31页第14页/共31页第15页/共31页第16页/共31页第17页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7第18页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3

2、使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7DNA分子大小迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子越大，摩擦阻力越大，同时大分子通过凝胶孔径的效率也低于较小的分子，所以分子大的迁移慢。等量的空间结构，紧密的电泳快（超螺旋线性DNA）一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。第19页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7简言之，浓度越大，分子孔径就越小，DNA迁移速率就越低，反之迁移速率就大。另外，浓度也跟凝胶的分辨率有关，浓度越大，分辨率越高，但分离的片段就越小。第20

3、页/共31页第21页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。第22页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7 低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨效果好，凝胶上所加电压不应超过5-8V/cm第23页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7 包括标准琼脂糖和低熔点琼脂糖以及正在研制的介于二者之间的琼脂糖。其分辨率等各有不同。第24页

4、/共31页第25页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7溶液pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液pH还会影响到其电泳方向;溶液的离子强度过低，会使电导率降低，DNA不是全然不动就是迁移极慢；而离子过强时，电导率上升，会产生大量热能，使凝胶变化甚至熔化，也会使DNA变性。第26页/共31页DNA分子的大小1凝胶的浓度2DNA的构象3使用的电压4琼脂糖的种类5电泳缓冲液6嵌入染料的存在7染色剂溴化乙锭插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加，因此，线性DNA-染

5、料复合物在凝胶中的迁移率约降低15%。第27页/共31页问题问题原因原因解决办法解决办法DNADNA带模糊带模糊1) DNA降解避免核酸酶污染2) 电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液3) 所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度30；巨大DNA链电泳，温度应15；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力4) DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量5) DNA样含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐6) 有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白7) DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA第2

6、8页/共31页问题问题原因原因解决办法解决办法不规则不规则DNA带迁移带迁移1) 对于/Hind III片段cos位点复性电泳前于65加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟2) 电泳条件不合适电泳电压不超过20V/cm；温度30；经常更换电泳缓冲液3) DNA变性以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热带弱或无带弱或无DNA带带1) DNA的上样量不够增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低2) DNA降解避免DNA的核酸酶污染3) DNA走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度4) 对于EB染色的DNA，所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源第29页/共31页问题问题原因原因解决办法解决办法DNADNA带缺失带缺失1) 小DNA带走出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度2) 分子大小相近的DNA带不易分辨增