第七章 常用分子生物学技术

1、第七章第七章 常用分子生物学技术常用分子生物学技术第一节第一节 基因工程基因工程 第二节第二节 PCR技术技术第第 一一 节节 基因工程基因工程 Genetic engineering目的目的 分离获得某一感兴趣的基因或分离获得某一感兴趣的基因或DNA 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic engineering) 利用基利用基因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达因克隆方法获取目的基因并使克隆的基因表达为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物为蛋白质或多肽产物或定向改造细胞乃至生物个体的特征及相关的工作称基因工程个体的特征及相

2、关的工作称基因工程1、基因工程、基因工程2、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease, RE)是识别是识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或其周并在识别位点或其周围切割双链围切割双链DNA的一类内切酶。的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam H3、基因载体、基因载体为携带目的基因，实现其无性繁殖或表为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA粘粒粘粒DNA

3、克隆载体克隆载体(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNA序列被扩增而特意序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。设计的载体称为克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为使插入的外源为使插入的外源DNA序列可转录翻译成序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。多肽链而特意设计的载体称为表达载体。 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 多核甘酸激酶等多核甘酸激酶等重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工

4、具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸羟基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无

5、外切活性，而无53 外切活性。常用于外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基三、重组三、重组DNA技术的基本原理技术的基本原理应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗

6、传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的人工的DNA）与载体）与载体DNA接合成一具有自我复制能接合成一具有自我复制能力的力的DNA分子分子复制子复制子(replicon)，继而通过转化，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子，也称基因克隆或基因克隆或 DNA克隆克隆 。 基本原理基本原理目的基因的获取目的基因的获取DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和

7、构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 重组重组DNADNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 表表表达目的基因表达目的基因 第二节 PCR概述PCR技术的创建技术的创建故事发生在1983年的春夏之交Kary B. Mullis (1944 -)PCR的发明人的发明人PCR: Polymerase Chain ReactionKary B. Mullis（1944）Kary B. Mull

8、is (1944 -)，在在Cetus公司工作期间，公司工作期间，发明了发明了PCR。 他原本是他原本是要合成要合成DNA引物来进行引物来进行测序工作，测序工作， 却常为没有却常为没有足够多的模板足够多的模板DNA而烦而烦恼。恼。1983年春夏之交的年春夏之交的一个晚上，他开车去乡一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用下别墅的路上萌发了用引物引物（而不是一个（而不是一个引物）引物）去扩增模板去扩增模板DNA 的想法的想法.Mullis开车的时候开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面的两条链，自己的车和对面开来的车象是开来的车象是DNA聚合酶，面对

9、面地合成着聚合酶，面对面地合成着DNA， 1983年年9月中旬月中旬 1983年春，年春，Mullis发展出发展出PCR的概念；的概念； 1983年年9月，月，Mullis用大肠杆菌用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个聚合酶做了第一个PCR实实验，只用一个循环；验，只用一个循环； 1983年年12月，用同位素标记法看到了月，用同位素标记法看到了10个循环后的个循环后的49 bp长度长度的的第一个第一个PCR片断；片断； 1985年年12月月20日，日，Mullis的同事的同事Saiki在在Science上发了一篇上发了一篇论文，方法中用了论文，方法中用了PCR技术，导致技术，导致Mullis的文章

10、到处被拒；的文章到处被拒； 1985年年10月月25日申请了日申请了PCR的专利，的专利，1987年年7月月28日批准日批准（专利号（专利号4,683,202 ），这回），这回Mullis是第一发明人。是第一发明人。 1986年年5月，月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习始学习PCR的方法；的方法； 1986年年6月，月，Cetus公司纯化了第一种高温菌公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，聚合酶，Taq DNA polymerase，这是，这是85年春天年春天Mullis建议做的；建议做的； 1988年，第一台年，第一台PCR仪问世

11、；仪问世； 1991年，年，Hoffman LaRoche以以3亿美元的代价从亿美元的代价从Cetus公司获公司获得全权开发权。得全权开发权。 Mullis的上司有句的上司有句“名言名言”，“我们我们要扩增这么多要扩增这么多DNA样品有什么用样品有什么用”； 到了到了1991，Cetus公司以公司以3亿美元的亿美元的转让费将转让费将PCR相关专利转让给瑞士相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；的经营中又获得了数亿美元的分红； Mullis于于1993年获得诺贝尔化学奖，年获得诺贝尔化学奖，PCRPCR技术与体内技术与体内DN

12、ADNA复制的区别：复制的区别： 1. PCR 1. PCR不需要解旋酶；体内不需要解旋酶；体内DNADNA复制需要；复制需要； 2. PCR 2. PCR需要耐热的需要耐热的DNADNA聚合酶（常用聚合酶（常用TaqDNATaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性；聚合酶），而生物体内的聚合酶在高温时会变性； 3. PCR 3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物体一般要经历三十多次循环，而生物体内内DNADNA复制需要生物体自身的复制。复制需要生物体自身的复制。 一、一、PCRPCR的定义的定义 在引物指导下由酶催化的在引物指导下由酶催化的对特定克隆或基因组对特定克隆或基因组

13、DNADNA序列序列进行的体外扩增反应。进行的体外扩增反应。二、二、PCR 原理原理过过 程程变性变性引物退火引物退火延伸延伸PCRPCR技术原理技术原理类似于类似于DNADNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。两端互补的寡核苷酸引物。模板模板DNADNA变性：变性：加热至加热至9494左右，双链左右，双链DNADNA解离成单链；解离成单链；模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火( (复性复性) )：5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；引物的延伸：引物的延伸：

14、在在Taq DNATaq DNA聚合酶作用下，以聚合酶作用下，以dNTPdNTP为原料，为原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的双链；一条新的双链；重复循环重复循环变性变性-退火退火-延伸延伸三过程，使三过程，使DNADNA扩增量呈指扩增量呈指数上升。数上升。 PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环-变性变性PCR循环循环退退火火PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR循环循环延伸延伸PCR整个过程整个过程PCR productPCR product三、PCR的反应体系和

15、方法 PCR管加热使模板变性, 退火使引物与模板DNA互补,延伸需将反应温度升至中温( 72),在Tap多聚酶的作用下,以dNTP为原料,以引物为复制的起点,合成新链。 如此重复改变反应温度,即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍; 将扩增产物进行电泳,经溴化乙锭染色,在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。 缓冲液原料引物模板 DNA聚合酶1）PCR反应成分（1）模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 一般100ng DNA模板/

16、100L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。3 PCR反应条件 经典循环参数（500bp以内）30次 可用于检测特定基因序列的存在或缺失。 逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增6) 荧光定量荧光定量 PCR（real-time PCR) 荧光定量荧光定量 PCR仪仪7）重组PCR 将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。 即先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物进行PCR扩增。所得到的产物是一个重组的DNA.五五 PCR PCR反应特点反应特点（一）特异性强（一）特异性强 靶序列的特异性决定扩增产物的特异性。靶序列的特异性决定扩

17、增产物的特异性。 在较高的温度下进行，引物结合的特异性在较高的温度下进行，引物结合的特异性大大增加。大大增加。（二）灵敏度高（二）灵敏度高 PCR PCR 产物的生成量是以指数方式增加产物的生成量是以指数方式增加 从从 100 100 万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞 在细菌学中最小检出率为在细菌学中最小检出率为3 3个细菌个细菌（三）简便、快速（三）简便、快速 在在DNADNA扩增仪中进行扩增仪中进行变性变性- -退火退火- -延伸延伸反应，一般反应，一般1 13 3 小时完成。小时完成。（四）对模板的纯度要求低（四）对模板的纯度要求低 可直接用临床标本如血液、体腔液、洗可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNADNA或或RNARNA扩增检测。扩增检测。 I am really happy to be y