国内的溶菌酶的应用与发展

1、国的嫁菌酶的应用与发展滚菌酶，又称胞壁质酶。球蛋勺G、N乙犹胞壁质聚檐水鮮酶。 最早对嫁菌酶的研允起于N icolle 1907年发表的枯草芽胞杆苗中 的溶鮮子,1922年Flem ing等发现確人的唾液、眼汨中存在有能够 嫁鮮细胞壁杀死细菌的酶，因而菠命名为溶菌酶1 o 1965年，英国 的菲利普等用X衍射比对溶蔺酶进行研允分析，第一个完全弄请了溶 菌酶的立体结构2 o此后人们发现涿菌酶/*泛地存在于壽等动物 组织及分泌物，植物及各种微生物中，其中淮.新鮮的呜蛋请中含量最 壽。溶菌酶可选择性地分鮮微生扬细胞壁的同肘不破坏其它组织，且 本身无毒无窖，因而它是一种天然的安全性能很好的杀苗剂，防腐

2、剂， 将可应用于食阮防庸、箧药制利目用化工等行业。在我国，嫁蔺酶的 应用囲和应用量还比较有限，但可以预计，溶菌将会是应用于我国食 洗工业中一种重要的功能性食品添加利。嫁育酶的结构特盍和抗菌作用机制结构特盍与复杂性大多数鸡罢请溶菌酶是由129个敎基酸俎成的减性球状蛋勺，相 对分子量柱1400018000o其等电点可达10 7,存扈4个二硫 键。正常条件下嫁菌酶作用的最适温度为45°C50 °C。蛋请嫁菌酶 在低温干煤下可长期保存。其纯品为自色粉未状结晶，无臭、味甜， 易溶于低浓度的食盐水。在喊性条件下易彼破坏，但淮.酸性嫁液中其 化学性质稳定，热稳定性很强 確pH47 M,1

3、00T下处理1m in 酶仍保持良好的活性，在pH3时,100°C加热处理45m in仍能保持活 性3。涿菌酶旌.水溶液中6215 °C下，维持30min则完全失活確20 15%的乙醸中，亦6215 °C下维持20m in而不失活4。王玮等5研 允表朗。在一元醇和二元醇涿液中涿菌酶分子的稳定性均随着醸浓度 的增大而提壽。人落菌酶分子量为14600,由130个氨基酸组成，也 存在4个二硫键,其酶活性比鸣蛋请溶菌酶壽2信左右。在生尹或应 用嫁菌酶肘，由于工艺或环境的变化，极易11成酶的变性失活，因此必 须采取一定的手段使蛋自复性，减夕损失。史晋坪等7研兗发现， 当酶浓

4、度较低时,017mol/L的盐酸孤和可使嫁茵酶完全复性。此外， 嫁菌酶和其它酶具有相似的性质、Karupp iah等8研允表朗，向复 性嫁液中加入适量的（3环糊精，可使变性的碳酸脱水酶的复性率达 到80%。董晓熬等9利用卩环糊精和十六烷基三甲基涣化的朕合作 用，在适?宜盐酸脈浓度下，溶菌酶可完全复性。王彦等利用富子交换色 谱法研允发现，当复性缓冲液中不含其它盐类时，腺浓度为210mol/L 时复性尹率最需，当腸浓度壽肘，硫酸銭能很好地提壽溶苗酶的复性 回收率。涿菌酶的抗菌作用机制目前己知的几种溶菌酶有:-N -乙虢己毎胺酶、犹廣酶p-1,3, p-1,6 葡聚糖酶和甘黑聚艇酶、几丁质酶、璘酸甘

5、獴糖酶脱、乙軌壳多毎酶 11o参与细菌细胞璧涿鮮作用的涿苗酶丸致可分为作用于毎苜键和 作用于肽和犹胺部分的两类。N 乙犹己糖胺酶、（31, 3, P 1, 6葡聚毎酶等主要作用于糖苜键，使热苜键断裂，破坏细胞壁的分 子结构，而犹腰酶等则主要作用于多肽,使多肽断裂。以N乙虢己 糖胺酶为例，N乙犹己糖胺酶能够侬化水鮮细胞壁肽聚毎分子中的N乙犹胞壁酸(NAM )与N乙犹葡萄毎氨(NAG)之间的卩1,4毎昔键，使肽聚热分子发生断裂,使细胞壁外两側滚透压夾衡，造成细胞破 裂,导致微生扬因细胞壁涿鮮而彼杀死12氏阳性菌由于两者细胞璧 中肽聚糖含量不同而存亦差异,G+细胞壁含80%肽聚毎，而G细胞壁 只有在

6、壁层含有少量肽聚毎。结晶去是传统的提取常菌酶的方出，此方由原料易得，制备过程不是 很烦琐。起先MayerAbraham等硏兗并利用此岀，于1937年获得结 晶状扬质13,1945年A Iderton等提出直接结晶比制备嫁菌酶的方 法14o景芝等15对传统结晶去做出了改进，通过调整透析液pH 值，加入确酸盐，再调整其pH值，然后离心去除杂质得到纯化液，使 产率提壽，活性增加。畜子交换层析法离子交换层析法是很据各种蛋自质所带电持数的不同而与禽子交换 対之间结合力的差异，进而将不同蛋勺质分富的技术。该法应用于溶 菌酶分富始于80年代，由于其襟作简便、壽效、成本低、可旨动化 连续操作的优点，一直以来都

7、是溶菌酶生产的常用方法16o目前国外 常用的离子交换剂有Duolite - 464. 724、732弱酸性阳离子交换树 脂、D903, 201大孔畜子交换树脂、软甲基纤维素(CMC)和缓甲 基琼脂無等17o汆宏新等18采用724树脂，裳粒后抽提液缓慢流 入粒中，用缓冲液洗涤，再用硫酸钱洗脱，结果表朗724树脂的吸附率 达到8315%o由于Duolite464非常适合于连续自动化操作，因此利 用它来分富纯化嫁苗酶，可取得较需的尹率。如LiChan等19用Duolite-464从性质均一的蛋请嫁液中分离溶菌酶，使溶菌酶的回收率达 90 % 95 %o亲和屋析法桌和层析法是根据酶£作用底杨

8、的特异性亲和能力，利用酶分子 独有的专一性结合住点或结构性质的分离方法20】。它的应用始于 上世纪70年，由于底杨可以专一性与溶菌酶结合，进而与其它蛋自分 离，是一种爲赦的分需方法。目侖利用桌和层析法分富溶菌酶的报导 很多，如HeLZ等21采用多步桌和爰析法分离纯化溶茵酶，结果表朗， 利用三桌和过滤糸统从原料中纯化落菌酶，与一步法相比产率从61% 提壽到96%。超.滤超滤是一种新兴分离纯化技术，利用控制艇滤膜孔径丸小来滤过杂 质,水及小分子杨质可以通过，从而获取尹物O亦反彖析及浓缩等工艺 中广泛应用，同时在蛋勺质分富中应用也开始兴起_。与传统生化分禽 技术相比，它的优盍是尹的并出量需、杂质少、

9、绫度相对较壽。A- 2000年,GhoshR等22采用小型的中空纤维超滤糸统（30 kDa MWCO ,聚巩膜）从罢请干粉中分离溶苗酶，溶菌酶选择性透过膜，而 其它大分子蛋勺质彼膜所嫁菌酶的粗提液经过超谑、技术后，有 时部分杂质如无机富子等未能全部除去若将超.滤与结晶法，或是与% 子交换法等结合将取得精制诲苗酶。绅艳而等23M道,超滤液缩溶 苗酶经CMSepharose FF阳离子交换粒后，纯度提需2119得。潮等 24研兗表朗，将确酸盐缓冲液稀猝10僖，亦24M Pa下均质，利用嶺紆 相对分子质量为30000的聚瞇巩（PES）膜进行超，溶茵酶制涪力达 到 1461 Ou /mg 涿菌酶活性的

10、测定目15，国外对嫁菌酶活性的测定方法，主要有比浊法、紫外分光光度 矗、比色测定法、琼脂火箭糖电泳法和壽效液相色谱法等，但上述各 种方法中均存在一定的缺盍，如比迪*干扰因素多，重复性差，对单个 样凤测定速度快，比色法襟作简单但误差较大，因此，各种方法都在不 停改进中。传统方比测定嫁苗酶活性肘要将涿微球茵制成冻干粉，此 过程不仅步骤烦琐而且易隹成细菌大量死亡，影响结黑。玉萍等向溶 壁微球蔺直接加保护利（20%的甘油）置于普通采取了类似的方法。采 用聚苯乙烯微量反应板，建立了微量快速比迪检测溶蔺酶的方法，使 栋本用量癞少，反应肘间缩短，灵敘度较好。近年来，许多报道釆用栋 记乙二醸化几丁冰箔冷冻，使

11、用时鮮冻，读第1min的吸光度值和第 2min的浹光度值即可。使溶菌酶的测定方法灵加节约需效，准确性又 好。涿菌酶在食品、生物医药等工业中的应用溶菌酶作为一种夭然罢勺质，能在胃肠彼苗化和吸收，对人体无 毒窖作用，是一种安全糸数很需的食阮保鮮利、營养保健品和药為。 由于涿菌酶具有良好的理化特性，具有一定的保健作用，如在 化妆阮中用可谄除粉刺， 使皮肤滑嫩，促进皮肤的新代； 有止 血, 促进组织再生的作用,如在牙青中添加可防止牙龈出血.保 护牙龈并具有杀菌作用。因此嫁茵酶的应用领域非魯/泛,在食洗. 医药、生物工程等方面却具有很大的应用前景。此外，落菌酶除作为 医药原材料外，仅在食品防扁.强化方面

12、市场就比较可观，如乳制 品、肉制洗、酒类发酵、水果防屬等方面。随着对溶菌酶的硏兗的深 入和应用尹的不断开发，溶菌酶一旦彼人们认识接受，其对市场的 占有率将大幅提壽。溶菌酶亦食品中的应用溶菌酶柱孔制洗中的应用人乳与牛孔的最大差别之一在于嫁菌酶的含量，亦欧洲嫁菌酶己经广 泛用于婴儿食凤添加利，将一定量的溶苗酶添加到牛乳及其制品中， 使牛乳人孔化，能够强化血请夭菌蛋自，丫 球蛋勺等防御因子，抑制肠 道中腐败性细菌的增疚,增强婴儿对病蔺的抵抗力。因此，旌.牛乳或奶 粉中添加一之量嫁蔺酶，不但防扁，而且强化營养,有利于一婴儿健康成 长。此外，柱奶酪产业诲菌酶也被广泛使用，如淮.干酪生产中格代論酸 盐，加

13、入01001%的溶菌酶，可防止干酪产毛，保持香味扬质丁酸。德国 于1995年11月22目发布了奶酪法规，妣准使用溶苗酶来阻止亦丰硬 奶酪的生尹中由庆氧胞子增疚所引起的胀毛现象。涿菌酶在肉制阮中的应用低温肉制品由于口感鮮嫩，營养丰富，获得谄费者的喜爱。但由于肉类 冷藏的温度，并不能彻底杀死微生物或抑制其生长，因而保鮮期短，不 能满足谄费者需求。溶菌酶本身无毒、无害，可省代如苯甲酸及其钠 盐等化学防腐剂添加到肉制品中，能有效延长食品保质期。采用0105%落蔺酶和0105% N isin混合液保鮮赭肉，4°C下可保鮮 12d,真空包就保鮮期可达24do A此基础上添加了 18%NaCl和4

14、15% 葡萄糖组成复合保舞利，用于小包裝分劃冷却肉的保笔椽质期朗显 提壽。同样，曾友朗等将嫁笛酶与N isin、复合璘酸盐、茶多酚.酪 肮酸钠俎成复合保鮮剂与鮮肉混合，制成盐水火腿,其保质期可达3 个月。同肘，嫁菌酶在红肠的加工，延长其货架期方面的报道也非常 多。卷体上涿菌酶亦由制品上的保鮮作用己经得到认可，并且取得了 不少的进展,各种相关工作也亦/泛展开。溶笛酶在海产品和水并品保鮮上的应用研允采用0105%的溶菌酶、 115%甘氮酸和3%的食盐溶液中将海产品或水尹品没请5m in,沥干 水分，常温下保存9d后无异味、无色年雯化落菌酶的使用，极大提為 了海产品或水产品的保舞期，对其儲存运输等带

15、来了很大的方便。溶菌酶亦低度酒及饮料中的应用在低度酒中添加嫁茵酶不仅对酒的风味无任何不良影响，还可防止尹 酸苗生长，是低度酒良好的防扁利。在目本请酒部分微生物不能生存, 但有一种叫做火醪菌的孔酸苗则能生长，并产酸使酒发臭，添加溶菌 酶后火落菌彼有效抑制，成功代椁水酸作卩方屬剂用于请酒中，向葡萄 酒中加入一定量的涿菌酶，可以大丸减少SO2的使用量，减小了 SO2使用过多可能对人体适成的毒窖作用。涿菌酶在基因工程和酶工程上的应用随着生扬科学的发展，溶菌酶己成为基因工程及酶工程中必、不可少的 工具酶，用以制造和提取茵体的活性扬质如核酸，酶及活性多肽等 利 用其专一性水鮮细胞壁的特点，有助于人们对细胞

16、壁细微结构的认 识，为我们深入研允细胞璧的构建打下了坚卖的基础，同时作为是一 种重要的破璧酶，亦原生质体的制备方面提供了新的方去，因此嫁茵 酶彼/泛应用于生物技术、生扬工程中。嫁茵酶在抗菌苗炎、增强免 疫力方面的应用嫁菌酶对G+、枯草杆茵等有很好的杀夭作用，对丸 肠杆蔺、普通变球苗等G也具有一定程度溶鮮。此外，落苗酶£抗 菌素合用效果灵佳。因而，溶菌酶广泛应用于医药行业,如利用溶菌酶 悟疗各种五官科炎癌，尤其对急性炎癌如急性咽炎、急性喉炎、急性 中耳炎等效果朗显。溶苗酶在多种疾病诊断方面的应用，正常情况下，人体尿液中一般只 存亦少量溶菌酶，因此测量尿中涿菌酶含量，有助于检测肾小管功能

17、 障碍性疾病。同肘，烧伤病人分陆的嫁菌酶比带人多出几得，也可亦 尿液中检出，有助于对手术移植排斥、烧伤严重程度的判断。此外，血 请中涿菌酶含量壽低对自血病的诊断起辅助作用。首丸把血请溶菌酶 水平的测之作为勺血病分型的俅据，提供了诊斯急性勺血病的新方 法O我国嫁茵酶的生产应用现状及前景随着环境的污染目益严重, 科学技术的进步和人民生话水平的提爲，人们对食為和医药的安全性 要求越来越需，许多对禁些化学防庸利己限制使用，因此爲效、妄全、 具有天然话性成分的溶菌酶势必僖受人们的关注。q前，国外对溶菌 酶进行了轶竦入的研克，我国对涿菌酶的硏究、应用起.步较娩,虽然 相继开展了一些有关徐菌酶提取和应用方面

18、的硏允工作，但£发达 相比溶菌酶制适业规模小、设备和生产技术相对落后。当前，国外主 要从蛋请中提取溶菌酶，因为从蛋请中提取嫁菌酶，是一项生产相对 简单、投脊较少、见效快的工程，对于畜产凤深加工、综合利用，拘 有巨大的经济价值。蛋请涿茵酶在国外己于20世纪80年代进入 规模化生产，上世纪90年代未以来，己形成近千吨的市场规模，嫁苗 酶生尹厂彖主要分布在欧美亚等地。其中丹麦、加拿大占世界市场的 -丰以上，由于我国生物酶工程研兗起步比较喷，我国子20世纪80 年代对蛋请溶菌酶技术开始研允，己多次列为“863 ”计划及“十五 计划”等的重点科硏攻关项目。目前国己投产的蛋请溶酶，才能达到 有效的防扁效果。其次，为了灵好的发挥落菌酶防屬作用，可以占其它 杨质配比