菌落总数检测操作规程国标版

1、山西梁汾醋业有限公司文件类别及编号：LF-GC-01版次共贞第贞菌落总数测定标准操作规程制订年份：年制订人：审核人：批准人：制订日期：审核日期：批准日期：颁发部门：分发部门：生效日期：菌落总数测定的标准操作规程1. 目的规范山西老陈醋 菌落'总数测定的操作规程，保证山西老陈醋产品的质量2. 适用范围酿造食醋和配制食醋菌落总数的测定3. 仪器设备包温培养箱，冰箱，包温水浴箱，天平（0.1g），均质器，振荡器；无菌吸管1ml（0.01刻度）、10ml（0.1ml刻度）或微量移液器及吸头；无菌锥型瓶，250ml/500ml;无菌培养皿：直径90mm； PH计或精密PH试纸；放大镜或菌落计数器

2、4. 培养基和试剂 4.1平板计数琼脂培养基成分：胰蛋白豚5.0g酵母浸膏2.5g葡萄糖1.0g琼脂15.0g蒸僻水1000mlPH7.0 土 0.2制法：将上述加丁蒸僻水中，煮沸溶解，调节 PH分装试管或锥型瓶，121 C高压灭菌15min。4.2磷酸盐缓冲液 成分：磷酸二氢钾（KHP。）34.0g蒸僧水500mlPH 7.2制法：贮存液：称取34.0g磷酸二氢钾溶于500ml蒸僻水中，用大约175ml的1mol/L氢氧化钠溶液调节PH,蒸僻水稀释至1000ml存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25ml,用蒸僻水稀释至1000ml,分装于适宜容器中，121摄氏 度高压灭菌15分钟。4.3无菌生理

3、盐水成分：氯化钠 8.5g蒸僧水 1000ml制法：8.5克氯化钠溶于100ml蒸僻水中121摄氏度高压灭菌15分钟。5检验程序7检样25 g(mL)样品+225 mL稀释液，均质1 r10倍系歹0稀释i 选择2-3个适宜稀释度的样品均液，各取1ml分别加入无菌培养皿内I每也中加入15ml-20ml平板计数琼脂培养基，混匀1 F培养1 r计数各平板菌落数 * 计算菌落总数报告6操作步骤6.1样品的稀释6.1.1固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液 或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min10000 r/min均质1min 2min,或放入盛有225 mL稀释液的

4、无菌均质袋中，用拍击式均质器 拍打1 min2 min,制成1:10的样品匀液。6.1.2液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。6.1.3用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL,沿管 壁缓慢注于盛有9 mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不 要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹打使其混合 均匀，制成1:100的样品匀液。6.1.4按1.4.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释 一次，换用1次1 mL无菌吸管或吸头。

5、6.1.5根据对样品污染状况的估计，选择2个3个适宜稀释度的样品 匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，吸取1 mL 样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，分别吸取 1mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。6.1.6及时将15 mL20mL冷却至46C的平板计数琼脂培养基（可放 置于46 士 1CC恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混 合均匀。6.2培养6.2.1待琼脂凝固后，将平板翻转，36C 士 1 C培养48 h士 2 h。水产品 30 C 士 1C 培养 72 h士 3 h。6.2.2如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后

6、的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL）,凝固后翻转平板，按1.4.2.1条件进行培养。6.3菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应 的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-forming units , CFU) 表示。6.3.1选取菌落数在30CFU300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计 数菌落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于 300CFU的 可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。6.3.2其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无 片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半

7、，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2, 代表一个平板菌落数。6.3.3当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链 作为一个菌落计数。7结果与报告7.1菌落总数的计算方法7.1.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g (mL)样品中菌落总数结果。7.1.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算：N =工 C/(n1 +0.1n2 )d,(1)式中：N样品中菌落数；EC平板(含适宜范围菌落数的平板)菌落数之和;n1第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；n2第二稀释度

8、（高稀释倍数）平板个数；d稀释因子（第一稀释度）。示例：N =工 C/（n1 +0.1n2 ）d=（232+244+33+35）/2+（0.1 X 2） X 10-2=544/0.022=24727上述数据按1.6.2数字修约后，表示为25000或2.5X 104。7.1.3若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300 CFU,则对稀释度最 高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数 乘以最高稀释倍数计算。7.1.4若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.1.5若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以 小于1乘以最低稀释倍数计算。7.1.6若所有稀释度的平板菌落数均不在 30 CFU300 CFU之间，其 中一部分小于30 CFU或大于300 CFU时，则以最接近 30 CFU或 300 CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。7.2菌落总数的报告7.2.1菌落数小于100 CFU时，按“四舍五入”原则修约，以整数报 告。7.2.2菌落数大于或等于100 CFU时，第3位数字采用“四舍五入” 原则修约后，取前2位数字，后面用0