实验四从琼脂糖凝胶中回收并纯化DNA片段ppt课件

1、实验四实验四从琼脂糖凝胶中回收并从琼脂糖凝胶中回收并纯化纯化DNA片段片段 一、实验目的一、实验目的v学习经琼脂糖凝胶电泳分别后回收并纯化学习经琼脂糖凝胶电泳分别后回收并纯化DNADNA片段片段的方法的方法二、实验原理二、实验原理v将将DNA样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割样品在琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切割下含目的下含目的DNA片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作片段的凝胶块；在高盐和促溶剂的作用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶用下，琼脂糖聚合物中糖之间的氢键断裂而迅速溶解，解，DNA就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到就从胶基质中释放出来并选择性地吸附到球状的硅胶颗料或特定的

2、柱子上；球状的硅胶颗料或特定的柱子上； v然后用高盐缓冲液洗涤除去剩余的琼脂糖，再用含然后用高盐缓冲液洗涤除去剩余的琼脂糖，再用含乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用乙醇的缓冲液洗去盐和染料。最后用TETE缓冲液或水缓冲液或水将球状硅胶颗粒或柱子上的将球状硅胶颗粒或柱子上的DNADNA洗脱下来。回收纯洗脱下来。回收纯化后的化后的DNADNA可直接用于可直接用于DNADNA的衔接反响、标志反响、的衔接反响、标志反响、测序反响或测序反响或DNADNA的微量注射等研讨。的微量注射等研讨。 三、实验资料三、实验资料 v水浴锅、离心机、移液器水浴锅、离心机、移液器vPCR扩增的扩增的Rv1791基因基因vA

3、garose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 Tarakav试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合试剂盒采用了独特的凝胶融解系统，结合DNA制备制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作膜技术，具有高效、快速、方便之特点，全套操作只需只需30分钟便可完成。分钟便可完成。v本试剂盒回收纯化的本试剂盒回收纯化的DNA片段纯度高，完好性好，片段纯度高，完好性好，可直接用于衔接反响、可直接用于衔接反响、PCR扩增、扩增、DNA测序等各种测序等各种分子生物学实验。分子生物学实验。 四、实验步骤四、实验步骤1 1实验三中的实验三中的PCRPCR产物进展产物进展1%1%

4、琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶电泳。 2 2在紫外灯下切出含有目的在紫外灯下切出含有目的DNADNA的琼脂糖凝胶，用的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶外表的液体。纸巾吸尽凝胶外表的液体。 尽量切除不含目的尽量切除不含目的DNADNA部分的凝胶，尽量减小凝胶部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高体积，提高DNADNA回收率。切胶时不要将回收率。切胶时不要将DNADNA长时间暴长时间暴露于紫外灯下，以防止露于紫外灯下，以防止DNADNA损伤。损伤。 3 3切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤切碎胶块。胶块切碎后可以减少步骤6 6的胶块融的胶块融化时间，提高化时间，提高DNADNA的回收率。的回收率。 4 4称量胶块

5、分量，计算胶块体积。计算胶块体积称量胶块分量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以时，以1 mg=1 l1 mg=1 l进展计算。进展计算。 5 5向胶块中参与向胶块中参与3 3倍凝胶体积的倍凝胶体积的 胶块融化液胶块融化液DR-I DR-I BufferBuffer。6 6均匀混合后均匀混合后7575加热融化胶块，此时应延续振加热融化胶块，此时应延续振荡混合，使胶块充分融化约荡混合，使胶块充分融化约6 610min10min。7向上述胶块融化液中参与向上述胶块融化液中参与DR-I Buffer量的量的1/2体体积量的积量的DR-II Buffer，均匀混合。当分别小于，均匀混合。当分别小于400

6、 bp的的DNA片段时，应在此溶液中再参与终浓度为片段时，应在此溶液中再参与终浓度为20%的异丙醇。的异丙醇。 8离心柱放入搜集管中，将步骤离心柱放入搜集管中，将步骤7的溶液转移至离的溶液转移至离心柱中，心柱中，12,000 rpm，1min，弃滤液。，弃滤液。 如将滤液再参与离心柱中离心一次，可以提高如将滤液再参与离心柱中离心一次，可以提高DNA的回收率。的回收率。 9 9将将500 l500 l的的Rinse ARinse A参与离心柱中，参与离心柱中，12,000 12,000 rpmrpm，30s30s，弃滤液。，弃滤液。1010将将700 l700 l的的Rinse BRinse B

7、参与离心柱中，参与离心柱中，12,000 12,000 rpmrpm，30s30s，弃滤液。，弃滤液。 1111反复操作步骤反复操作步骤1010，将离心柱放入搜集管中，将离心柱放入搜集管中，12,000 rpm12,000 rpm，1min1min。 12将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中将离心柱放入新的指形管中，在离心柱膜的中央处参与央处参与25l的灭菌蒸馏水或的灭菌蒸馏水或Elution Buffer，室温，室温静置静置1min。 注把灭菌蒸馏水或注把灭菌蒸馏水或Elution Buffer加热至加热至60运用运用时有利于提高洗脱效率。时有利于提高洗脱效率。 1312,000 rpm，1min，洗脱