细胞化学术学习教案

1、会计学1第一页，共34页。20世纪世纪50年代，电子显微镜的问世，观察细胞的超微结构。到年代，电子显微镜的问世，观察细胞的超微结构。到80年代末，发展与完善了电镜细胞化学。年代末，发展与完善了电镜细胞化学。70年代由于细胞显微分光年代由于细胞显微分光光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量、光度法和荧光显微光度法的建立，使细胞化学的成分得以定量、形成定量细胞化学。形成定量细胞化学。80-90年代，流式细胞仪可对单细胞化学成年代，流式细胞仪可对单细胞化学成分定量分析的新技术（每秒可测上万个信息）。分定量分析的新技术（每秒可测上万个信息）。80年代后期年代后期(huq)，创立了激光扫

2、描共聚焦显微技术，对单个细胞进行，创立了激光扫描共聚焦显微技术，对单个细胞进行CT分析，通过计算机进行三微立体旋转，从各角度分析细胞深层和分析，通过计算机进行三微立体旋转，从各角度分析细胞深层和细胞表面的各种结构。可研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物细胞表面的各种结构。可研究活细胞和定量分析细胞内的遗传物质质DNA、RNA、细胞器、酶的含量等。、细胞器、酶的含量等。第1页/共34页第二页，共34页。基本原理基本原理(yunl)：细胞中的某种化学成分和其相应的底物呈现一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究。（特异性）细胞中的某种化学成分和其相

3、应的底物呈现一系列的化学反应，形成在显微镜下可见到的反应产物。对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究。（特异性）常用方法及原理常用方法及原理(yunl)：一一金属金属-金属盐沉淀法原理金属盐沉淀法原理(yunl)利用金、银、铜、铁、钴等金属化合物与细胞化学成分反应过程中生成有色沉淀。利用金、银、铜、铁、钴等金属化合物与细胞化学成分反应过程中生成有色沉淀。二二偶氮偶联法原理偶氮偶联法原理(yunl)用人工的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色素。用人工的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶氮偶联法反应，形成不溶性偶氮色

4、素。三三过碘酸过碘酸Schiff氏剂反应原理氏剂反应原理(yunl)四四多糖（糖原）多糖（糖原）+过碘酸过碘酸醛基醛基+Schiff氏剂氏剂紫红色化合物紫红色化合物显示细胞内糖类为显示细胞内糖类为PAS反应反应显示细胞核内为显示细胞核内为Feulgen反应反应第2页/共34页第三页，共34页。五五色素形成法显示酶定位的方法色素形成法显示酶定位的方法某化学物质在酶作用下在细胞某化学物质在酶作用下在细胞(xbo)局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、局部形成色素沉淀，包括四唑盐法、联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧联苯胺色素法、黑色素形成法等。其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多

5、种脱氢酶、转移酶等。化还原酶、多种脱氢酶、转移酶等。还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗还有脱氢酶显示法、底物标记法、荧光染色与免疫荧光法、酶标抗体法等。体法等。具体几项细胞具体几项细胞(xbo)化学技术简介：化学技术简介：（一）。孚尔更反应显示（一）。孚尔更反应显示DNA方法方法(Feulgen)用弱酸（用弱酸（!NHCL）水解析饱和中）水解析饱和中DNA，打开嘌呤硷基和脱氧核糖，打开嘌呤硷基和脱氧核糖核酸连接的双链，释放出醛基，与核酸连接的双链，释放出醛基，与Schiff试剂结合试剂结合紫红色化合物。紫红色化合物。用显微分光光度计定量分析。用显微分光光度计定量分析。（

6、二）。甲绿（二）。甲绿派郎宁显示派郎宁显示DNA和和RNA甲绿染甲绿染DNA，派郎宁染，派郎宁染RNA，它们并不是化学作用，而是与两种，它们并不是化学作用，而是与两种核酸的聚合程度有关。核酸的聚合程度有关。结果结果细胞细胞(xbo)核的核的DNA绿色绿色兰绿色兰绿色，核仁和胞质的，核仁和胞质的RNA呈红色。呈红色。（三）。丫叮橙（三）。丫叮橙（AO）荧光染色显示）荧光染色显示DNA和和RNAAO荧光染料与荧光染料与多聚体的多聚体的DNA和和RNA具有亲和力。结果具有亲和力。结果细胞细胞(xbo)核的核的DNA亮绿色亮绿色黄绿黄绿色荧光，核仁和胞质的色荧光，核仁和胞质的RNA呈红色荧光。呈红色荧

7、光。第3页/共34页第四页，共34页。（四）。多糖（四）。多糖(dutn)的显示法的显示法过碘酸雪夫（过碘酸雪夫（Schiff）氏剂反应）氏剂反应多糖多糖(dutn)（糖原）（糖原）+过碘酸过碘酸醛基醛基+Schiff氏剂氏剂紫紫红色化合物红色化合物（五）。酶的显示（五）。酶的显示1碱性磷酸酶的显示（钙碱性磷酸酶的显示（钙-钴法）钴法）用磷酸脂为底物，被碱性磷酸酶水解后释放出磷酸基，在用磷酸脂为底物，被碱性磷酸酶水解后释放出磷酸基，在pH9。29。8条件下，磷酸基与钙形成磷酸钙（无色）条件下，磷酸基与钙形成磷酸钙（无色）+硝酸钴硝酸钴磷酸钴（无色）磷酸钴（无色）+黄色硫化胺黄色硫化胺硫化胺钴（

8、黑色硫化胺钴（黑色）结果结果碱性磷酸酶成浅灰、灰黄、灰黑色。色深者表示酶多碱性磷酸酶成浅灰、灰黄、灰黑色。色深者表示酶多。对照组无反应。对照组无反应。第4页/共34页第五页，共34页。2三磷酸腺苷酶（三磷酸腺苷酶（ATPase）ATP酶使酶使ATPADP,释放磷酸基释放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）磷酸铅（黑色）结果结果ATP酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。对照组无反应。3葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶显示磷酸酶显示(xinsh)法（法（G-6-Pase）葡萄糖葡萄糖-6-磷酸酶作用葡萄糖磷酸酶作用葡萄糖-6-磷酸酶钠（钾）磷酸酶钠（钾）释放磷酸基释

9、放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）磷酸铅（黑色）结果结果G-6-P酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。对照组无反应。第5页/共34页第六页，共34页。ATPase第6页/共34页第七页，共34页。ATPase第7页/共34页第八页，共34页。ATPase第8页/共34页第九页，共34页。G-6-Pase第9页/共34页第十页，共34页。G-6-Pase第10页/共34页第十一页，共34页。G-6-Pase第11页/共34页第十二页，共34页。G-6-Pase第12页/共34页第十三页，共34页。45-核苷酸酶的显示法（核苷酸酶的显示法（5-Nucle

10、oyidase）此酶作用于此酶作用于5-核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，释放磷酸基核苷酸、水解嘌呤核苷酸或嘧啶核苷酸第五位碳原子的磷酸分子，释放磷酸基+硝酸铅硝酸铅磷酸铅（黑色）。磷酸铅（黑色）。结果结果5-核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。核苷酸酶呈棕黑色沉淀，色深者表示酶多。对照组无反应。免疫细胞化学术免疫细胞化学术应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内的多肽、蛋白质及膜抗原和受体等大分子物质的存在与分布。应用抗原与抗体结合的免疫学原理，检测细胞内的多肽、蛋白质及膜抗原和受体等大分子物质的存在与分布。其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用

11、广泛。其特点是特异性强、敏感性高、进展迅速，应用广泛。程程序：序：1抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）抗原（提取动物某些肽类或蛋白质）注入另一动物体内注入另一动物体内产生抗体（产生抗体（Ig）血清分离提取抗体血清分离提取抗体2抗体标记抗体标记抗体抗体+荧光素（异硫氰酸荧光素）荧光素（异硫氰酸荧光素）与相应与相应(xingyng)抗原结合呈黄绿色荧光抗原结合呈黄绿色荧光抗体抗体+辣根过氧化物酶（辣根过氧化物酶（HRP）与相应与相应(xingyng)抗原结合呈棕红色荧光抗原结合呈棕红色荧光第13页/共34页第十四页，共34页。方方法：法：（1）直接法直接法抗原抗原抗体抗体(kngt)直接结合直接结合

12、简便、迅速，简便、迅速，但是敏感性较低。但是敏感性较低。（2）间接法）间接法一抗体一抗体(kngt)（作为抗原）（作为抗原）注入物体内注入物体内产生第二抗体产生第二抗体(kngt)常用过氧化物酶常用过氧化物酶抗过氧化物酶复合物法（抗过氧化物酶复合物法（PAP法）。法）。较复杂，敏感性高较复杂，敏感性高（3）新进展新进展亲合素（卵白素）亲合素（卵白素）生物素法（生物素法（LAB法）法）桥连亲合素（卵白素）桥连亲合素（卵白素）生物素法（生物素法（BAB法）法）亲合素亲合素生物素生物素过氧化物酶复合物法（过氧化物酶复合物法（ABC法）法）(市场商品市场商品)第14页/共34页第十五页，共34页。第1

13、5页/共34页第十六页，共34页。第16页/共34页第十七页，共34页。组织培养术组织培养术:体外研究活细胞或组织的有价值的手段体外研究活细胞或组织的有价值的手段无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞无菌条件下，取活组织、活细胞（或传代培养的细胞株）株）培养液（天然或人工合成），在一定温度、培养液（天然或人工合成），在一定温度、O2、CO2、Ph培养（加某种受试因素）培养（加某种受试因素）倒倒置显微镜下观察：细胞活组织的增殖置显微镜下观察：细胞活组织的增殖(zngzh)、分化、运动、分化、运动、吞噬等。可连续录像观察。吞噬等。可连续录像观察。第17页/共34页第十八页，共34页。 正常

14、培养细胞正常培养细胞 第18页/共34页第十九页，共34页。中药组细胞中药组细胞 第19页/共34页第二十页，共34页。西药组细胞西药组细胞第20页/共34页第二十一页，共34页。对照组细胞对照组细胞第21页/共34页第二十二页，共34页。中药组细胞中药组细胞第22页/共34页第二十三页，共34页。原位杂交术原位杂交术:即核酸分子杂交组织化学术。即核酸分子杂交组织化学术。基本原理：两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过基本原理：两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合氢键结合(jih)，形成，形成DNA-DNA，DNA-RNA或或RNA-RNA双链分双链分子的特点，应用带有标记的（有

15、放射性同位素，如子的特点，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）、荧光素、生物素、地高辛等放射性物质）DNA或或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示。）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示。在光镜或电镜下观察目的在光镜或电镜下观察目的mRNA或或DNA的存在与定位。用此的存在与定位。用此技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。技术可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有极高的敏感

16、性和特异性，可进一步从分子水平探讨此方法有极高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平探讨细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分细胞的功能表达及其调控机制，已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。子生物学研究的重要手段。第23页/共34页第二十四页，共34页。放射自显影术放射自显影术:是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细胞的是通过活细胞对放射性物质的特异性摄入，以显示该细胞的功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性功能状态、或该物质在组织或细胞内的代谢过程。将放射性同位素或放射性同位素标记的物质注入体内，间隔一定时间同位素或放射性同位素标记的物质注入体

17、内，间隔一定时间后取材、制备切片后取材、制备切片(qipin)，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或，并在其上面涂以感光材料（感光乳胶或贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放贴以照相底片），置暗处暴光，再显影、定影。结果，在放射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的射性同位素或其标记物存在的部位，溴化银被还原为黑色的微细颗粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组微细颗粒，可在光镜或电镜下观察，从而获知被检物质在组织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如织或细胞内的分布及相对含量。在注入同位素标记物后，如果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的

18、动果有规律地在若干时间段取材，则可以观察到被检物质的动态分布及变化过程，如将态分布及变化过程，如将131I注入体内可以观察碘在甲状腺注入体内可以观察碘在甲状腺滤泡内的代谢情况；将滤泡内的代谢情况；将3H标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就标记的胸腺嘧啶核苷注入体内，就能研究蛋白质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。能研究蛋白质或核酸在组织、细胞内的代谢过程。第24页/共34页第二十五页，共34页。组织工程组织工程:是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。是用细胞培养术在体外模拟构建机体组织或器官的技术。组织工程主要包括以下四方面：组织工程主要包括以下四方面：获取生长旺盛的细胞获取生长旺盛的细胞

19、,即种子细胞。准备细胞外基质，即种子细胞。准备细胞外基质，包括生物材料包括生物材料(如牛胶原如牛胶原)及无毒、可被机体吸收的人工及无毒、可被机体吸收的人工合成高分子材料。构建组织或器官，即有目的地把种合成高分子材料。构建组织或器官，即有目的地把种子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要子细胞置于细胞外基质中进行三维培养，并形成所需要的形状。将构建物移植机体。目前正在研究构建的组的形状。将构建物移植机体。目前正在研究构建的组织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及织器官主要有皮肤、软骨、骨、肌腱、骨骼肌、血管及角膜等；其中以组织工程皮肤较为成功并已应用于临角膜等；其中以组织工程皮

20、肤较为成功并已应用于临床治疗烧伤床治疗烧伤(shoshng)、皮肤静脉性溃疡等疾病。、皮肤静脉性溃疡等疾病。第25页/共34页第二十六页，共34页。软骨软骨(rung)组织工程研组织工程研究进展究进展实验中的组织实验中的组织(zzh)(zzh)工程工程“耳耳” ” Cao YL Cao YL，et al: et al: Transplantation of Transplantation of chondrocytes utilizing chondrocytes utilizing a polymer-cell a polymer-cell construct construct toto

21、produce produce tissue engineered tissue engineered cartilage in the shape cartilage in the shape of a human ear of a human ear Plastic Reconstr Plastic Reconstr Surg,1977,100:297 Surg,1977,100:297 第26页/共34页第二十七页，共34页。第27页/共34页第二十八页，共34页。实验中的组织工程实验中的组织工程“耳耳”制备制备(zhbi)程序程序5、4“人耳人耳”。第28页/共34页第二十九页，共34

22、页。5形态计量术形态计量术形态计量术形态计量术是研究是研究(ynji)组织和细胞内各种有形成分的组织和细胞内各种有形成分的数量、体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究数量、体积、表面积等项的绝对或相对值的方法。研究(ynji)机体某些结构的立体数值的科学，称为体视学数机体某些结构的立体数值的科学，称为体视学数值以值以“量量”的概念进一步阐述了结构与功能关系及其病理的概念进一步阐述了结构与功能关系及其病理状态下发生的变化。目前常用的精密定量方法有以下几状态下发生的变化。目前常用的精密定量方法有以下几种：种：（1）显微分光光度术）显微分光光度术显微分光光度术是显微镜技术与分光光度技术的结合，显微分光光度术是显微镜技术与分光光度技术的结合，可测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶可测出细胞内各种化学成分的含量，如测定蛋白质、酶、脂类、糖及、脂类、糖及DNA与与RNA等含量。等含量。第29页/共34页第三十页，共34页。（2）显微荧光光度术）显微荧光光度术显微荧光光度术是利用显微荧光光度术是利用(lyng)对细胞内原有发荧光的物质，对细胞内原有发荧光的物质，或对细胞内各种化学成分用