重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

1、实验报告题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达指导老师：邓庆丽日期:2013/10/31-201311/1一. 实验目的：(1) 了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。(2) 了解降解物阻遏的现象及其机理。二. 实验原理：本实验使用的是载体是已重组好的pGFPuv ,宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白 GFP非目的蛋白即融合部分为标签6X His，用于单元 四的亲和层析分析。本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操

2、纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图 1所示：启动子阻遇基因终止子CAP结合位点启动子换纵序列络构基因 /P-乙A2日-半乳糖昔酶卜Y：透性醐】A：乙酰基转移酶卜图I.乳精操纵子的结构示意图乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。（1）诱导表达当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的 mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因GFP不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处于阻碍状态，如下图2所示：启动子阻调

3、基因终止子CAP皓含位点启动子廉缴序列目的基因 卜图L乳糖操纵子的调节机制。当有乳糖存在时，乳糖转化为异乳糖， 异乳糖作为诱导物与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白的构象发生改变，而不能结合到操纵序列上，RNA聚合酶可以从启动子向 3'端移动，于是，结构基因可以转录出mRNA,然后翻译出蛋白质。也就是说，当有乳糖存在时，乳糖操纵子被诱导，如下图 3所示：启动子阻遏基因终止子CAP结合位点曰动子操纵序列目的基因 异乳糖半乳糖昔醇.乳精图3.乳糖操纵子的调节机制*乳糖操纵子的诱导物是异乳糖。IPTG是异乳糖的结构类似物。由于IPTG不会被分解， 它的诱导作用是持久的。(2)葡萄糖降解物的阻遏作用代谢

4、物基因激活蛋白(Catabolite gene Activation Protein ) CAP,又称cAMP受体蛋白属 于激活蛋白的一种，对乳糖操纵子进行正调节。CAP分子内分别有 DNA结合区和cAMP结合区。当CAP与cAMP结合后，就可结合 DNA促进乳糖操纵子的转录。葡萄糖降解物能抑制腺昔酸环化酶的活性，并活化磷酸二酯酶的活性，从而降低cAMP的浓度，抑制乳糖操纵子的转录。本实验使用的表达载体 pGFPuv上含有乳糖操纵子的调节序列， 目的基因表达的是带 6 X His的重组绿色荧光蛋白。在 IPTG的诱导下，融合蛋白表达可增强 105倍，并且可用金 属螯合亲和层析分离纯化，最终获得

5、纯的重组绿色荧光蛋白。三. 材料与试剂：材料工程菌：BL21(DE3)p32a、BL21(DE3)pGFPuv试剂LB 液体培养基 ：蛋白月东(tryptone) 10g、酵母粉(yeast extract) 5g、NaCl 10g,加 800mL双蒸水溶解，用 10M NaOH调pH至7.2-7.5,定容至1000mL。分装，高压灭菌，4C保存。氨节青霉素溶液：无菌双蒸水配成100mg/mL,分装，-20C保存，使用终浓度为50g/mL 或 100 g/mL。IPTG溶液(100 mM ):将238.3mg IPTG溶解于10mL双蒸水，0.22 m细菌滤器过滤 除菌，分装，-20C保存备用

6、，贮存浓度为 100 mM。20%葡萄糖溶液超声平衡缓冲液：50mM Tris-HCl, 500mM NaCl pH7.0四. 实验仪器：超净工作台、 低温摇床、高速冷冻离心机、超声破碎仪等。五. 实验步骤、现象、结果及分析：1.工程菌的活化（10月30号教师准备）分别挑取工程菌 BL21（DE3）p32a 和BL21（DE3）pGFPuv 的单菌落接种到5mlLB液体培养基（含氨节，终浓度为100邱/mL,以下同）晚上7点接种37 C、250rpm 咛 14h过夜至对数生长期第二天早上9点 左右取出放入4 C备用2.放大（10月31号）往装于500ml三角瓶中的170ml LB液体培养基中加

7、入 170 L Amp，摇匀，取三支灭 菌试管，用5ml枪各加入5ml LB液体培养基（含氨节），分别编号为1#, 2#, 3#,剩下的 装于一角瓶中的液体培养基（含氨节），编号6#,全部按1: 50的比例接种菌种，操作如下：1#接种 100 L BL21(DE3)p32a2# 接种 100 L BL21(DE3)pGFPuv3# 接种 100 L BL21(DE3)pGFPuv6#接种3mL BL21(DE3) pGFPuv下午接种于37C、250rpm 咛约2h ,顺便配制单兀四蛋白质纯化及电泳所需试剂。3.诱导1#、 2#不需处理3#加入20 %砌糖250 L, 至终浓度为1.0% ；加

8、入25 L 100mM IPTG 至终浓度为 0.5mM。6#加入 100mM IPTG 约 750 L 至终 浓度为0.5mM。于25C、250rpm培养过夜4.收菌（注意米集标本并编号）（11月1号早上9点开始）从6#三角瓶培养的150mL菌液中取出5mL置于一支试管中（编号为4#）。分别从2 # , 3#, 4#物各取100 L于EP管 用于电泳。（相应编号为S2,S3,S4）。将1#, 2 # , 3#, 4#试管中的菌液分别收集到 4 个1.5mLEp离心管中（收3次），编上相应编号。1#,2 # , 3#离心弃上清（10000rpm离心1min） ; 4#第三次离心后上清液收集到另

9、一个Ep管，编号为5#。6#三角瓶中剩余菌液用两管50mL离心管于 8000rpm, 4C,离 心5min,弃上清收集凿体。5.观察及超声破碎于紫外灯下观察1# -5#管收集的菌体或上清液，观察哪支管有荧光(荧光强弱)，记录观察到的现象，并拍照。结果如下图一所示：图一：1# -5#管紫外观察结果，从左到右依 次为1# -5#管。(1) 全部菌体用50ml超声平衡缓冲液重悬(50mmol/L Tris-HCl , 500mmol/L NaCl pH7.0)，即每管用25ml超声缓冲 液重悬，用枪吹散，后倒入 50ml烧杯 中，置于装满碎冰的1L烧杯中，使小烧杯高出大烧杯1cm左右，便于超破时 观

10、察菌液液面。(2) 超声波破菌，破碎之前测得。回0为0.381，三周期后测得 OD00为0.134, 然后用50ml离心管收集并于8000rpm , 4C,离心10min,取上清(弃沉淀)， 保存于-20 C冰箱，下周层析实验备用。六. 思考与讨论(1)对紫外灯下观察到的结果作出解释。答：图一中从左到右依次为 1# -5#管，可以看出4#管绿色荧光最强，2#次之，其余1#、 3#、5#均无颜色。原因是1#管中质粒为非重组质粒 p32a,不含GFP,因而无法表达产生绿 色荧光蛋白，为阴性对照；2#管-4#管中大肠杆菌均含重组质粒pGFPuv, 2#管中未经诱导，绿色荧光蛋白为本底水平的表达，因而

11、显示出淡淡的绿色荧光；4#管中经过IPTG的诱导表达，GFP产量很高，因而显示出很深的绿色荧光；而3#管虽然加入了 IPTG进行诱导表达，但是还加入了浓度为 1%的葡萄糖，导致cAMP 浓度降低，从而抑制了乳糖操纵子上游的激活位点， 抑制了乳糖操纵子的转录， 因而无法产 生绿色荧光；5#管为4#管最后一次离心的上清液，因菌体未破碎，因而上清液中不含GFP,因而也就无法产生绿色荧光。(2) 为什么诱导表达的大肠杆菌要在其OD00浓度约为0.5时加入IPTG?答：大肠杆菌要在其 OQ00浓度约为0.5时基本进入对数生长期，菌体生长旺盛，增殖 快，对诱导表达而言，会有一个比较好的收率。若浓度较低时，菌体吸收的营养都用于表达 外源蛋白，势必会严重影响它的繁殖，菌体量少了，总的外源蛋白表达量也会变少，当在对