色谱分析第8章色谱的定性和定量分析

1、1色谱定性分析色谱定性分析利用已知标准物定性利用已知标准物定性利用检测器定性利用检测器定性联用方法定性联用方法定性化学方法定性化学方法定性平面色谱定性平面色谱定性本章内容提要本章内容提要色谱定量分析色谱定量分析定量分析的基本公式定量分析的基本公式峰面积的测定方法峰面积的测定方法定量校正因子定量校正因子定量方法定量方法影响因素影响因素方法验证方法验证2定性分析定性分析 对化合物“质”的分析 确定物质的组成组成和结构结构信息定性分析的工具定性分析的工具 色谱法色谱法：具备高度的分离分离效能一般用作分析混合物混合物的组成 波谱法波谱法：具备高度的鉴别鉴别效能一般用作鉴别纯品纯品的结构一、色谱的定性分

2、析一、色谱的定性分析3原理原理 相同色谱条件下(柱长、柱温、固定相、流动相)，组分有固定的色谱保留值(通常为保留时间) 。一般操作方法一般操作方法 将样品与已知标准物在同样色谱条件下分别分别测定 须有标准物须有标准物 通过比较保留值通过比较保留值( (通常是保留时间通常是保留时间) )的方法，的方法，找到各色谱峰所对应的组份找到各色谱峰所对应的组份1.1 利用已知标准物定性利用已知标准物定性4A-甲醇；甲醇；B-乙醇；乙醇；C-正丙醇；正丙醇；D-正丁醇；正丁醇；E-正戊醇正戊醇5特别注意特别注意保留时间不同，保留时间不同，肯定不是同一组份肯定不是同一组份保留时间相同，保留时间相同，可能是同一

3、组份可能是同一组份改变色谱柱或流动相，保留时间仍完全相同通常是同一组分通常是同一组分6标准加入法标准加入法 在得到未知样品的色谱图后，往未知样品中加入一定量的已知物质，在同样色谱条件下对比两色谱图中各峰的峰高。优点优点(最好方法最好方法) 当试样组份比较复杂，峰间距离太近，或操作条件不易控制，很难准确地测定其保留值时，可采用此法进行定性。判断的标准判断的标准 加入标准样后，使未知样色谱峰增高；加入标准样后，使未知样色谱峰增高； 改变色谱条件，上述色谱峰仍能增高。改变色谱条件，上述色谱峰仍能增高。7同一组分，进样量改变，峰高改变。但保同一组分，进样量改变，峰高改变。但保留时间和峰型不变。留时间和

4、峰型不变。80 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .3 50 .4 00 .0 00 .5 01 .0 01 .5 02 .0 02 .5 03 .0 03 .5 04 .0 04 .5 05 .0 05 .5 06 .0 06 .5 07 .0 0A UM in u te sU ra c ilE th y lp a ra b e nP ro p y lp a ra b e n例例1 19例例2 210原理原理 不同检测器对不同种类化合物有响应不同检测器对不同种类化合物有响应 氢火焰离子化氢火焰离子化FID有机化合物 电子捕获检测器电子捕获检测

5、器ECD 含卤素或硝基等强吸电子基团 火焰光度检测器火焰光度检测器FPD 含S或P 氮磷检测器氮磷检测器NPD 含N或P 紫外检测器紫外检测器UVD 含双键共轭结构双检测器体系双检测器体系 将两种检测器并联或串联 串联须将非破坏性检测器(TCD、UVD)置于前端 如果两种检测器均为破坏性的，则须并联。 常用FID-ECD、FPD-TCD、FPD-FID等1.2 利用检测器定性利用检测器定性11原理原理 将色谱(HPLC、GC)的高分离效能和波谱法(MS、IR、NMR)的高鉴别效能结合。气相色谱-质谱联用(GC-MS)气相色谱-红外光谱联用(GC-FTIR)液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)液

6、相色谱-核磁共振联用(HPLC-NMR)GC-MS和HPLC-MS已经成为鉴别复杂样品鉴别复杂样品的有效手段。 药物体内代谢物的研究 中药有效成分的研究1.3 联用方法定性联用方法定性12原理原理 含有特定官能团特定官能团的化合物可采用化学衍生法定性含羟基的化合物可与乙酸酐反应(提前提前)卤代烷可与乙醇-硝酸银反应(消失消失)伯胺、仲胺可与三氟乙酸酐反应(消失消失)烯烃可与溴化氢加成(延后延后)酮类化合物可与2,4-二硝基苯肼反应(消失消失)1.4 化学方法定性化学方法定性13原理原理 根据化合物在TLC板上的比移值比移值1.5 平面色谱法定性平面色谱法定性多用于反应过程的监测采用合适的显色方

7、法显色方法(UV、磷钼酸)点样须点重合点重合点注意观察各点的形状和形状和颜色颜色14定量分析定量分析 对化合物“量”的分析 确定样品中某一组分的准确含量准确含量定量分析的工具定量分析的工具 色谱法色谱法 具备高度的分离效能可测定复杂混合物中某一物质含量含量通常以峰面积峰面积或峰高峰高作为指标 波谱法波谱法 UV中通常用吸光度吸光度来测定含量二、色谱的定量分析二、色谱的定量分析152.1 定量分析的基本公式定量分析的基本公式原理原理 在某些限定条件下，检测器响应值响应值(色谱峰的峰面积峰面积或峰高峰高)与所测组分的质量或浓度成正比。 iiiiihAfCm mi 组分i的质量 Ci 组分i的浓度

8、fi 组分的校正因子(与检测器的性质和被测组分的性质有关) Ai 组分i的峰面积 hi 组分i的峰高161. 对称峰对称峰的峰高和峰面积的测定：峰高半峰宽A = 1.065hW1/2172.2 峰面积的准确测定峰面积的准确测定85. 015. 021bbhA2. 不对称峰不对称峰峰高和峰面积的测量：峰高峰宽的平均值b0 .15和b0.85峰高0.15处和峰高0.85处的峰宽18 不同物质由于物理和化学性质的差异，在同一色谱条件下的响应程度不同。 例如例如 含量相等均为50%的两个组分，色谱峰面积通常不相等。 因此需设立一个修饰峰面积的参数以校正上述偏差校正因子校正因子192.3 定量校正因子定

9、量校正因子 iiiiihAfCmI. 绝对校正因子绝对校正因子fi fi的物理意义的物理意义 单位峰面积所代表的i组分的量，是一个与i组分的物理化学性质物理化学性质和检测检测器的性质器的性质有关的常数。 定量校正定量校正 因子的计算公式为：因子的计算公式为：iiiAmf20 绝对校正因子fi的大小主要由操作条件操作条件和仪器的灵敏度灵敏度所决定。 校正因子既不容易准确测量，也无统一标准；当操作条件波动时， fi也发生变化。 fi无法直接应用，定量分析时，一般采用相对校正因子。21II. 相对校正因子相对校正因子(校正因子校正因子)f相对校正因子，简称为校正因子mi, ms被测物质、基准物质(s

10、)的质量(或浓度)Ai(hi), As(hs)被测物质、基准物质(s)的峰面积(或峰高)ssssiiiisihAcmhAcmfff22a) 质量校正因子质量校正因子(fm) 定义定义 当组分含量用质量来表示时的校正因子称当组分含量用质量来表示时的校正因子称为质量校正因子为质量校正因子 (fm),表示单位峰面积所代表的组表示单位峰面积所代表的组分质量，质量一般用分质量，质量一般用 g 或或 mg 表示。表示。 mi, ms 被测物质、基准物质的质量 Ai(hi), As(hs)被测物质、基准物质的峰面积 ssiimAmAmf23b) 摩尔校正因子摩尔校正因子(fM) 定义定义 组分含量用摩尔数表

11、示，表示单位峰组分含量用摩尔数表示，表示单位峰面积所代表的组分摩尔数面积所代表的组分摩尔数 Mi , Ms被测物质、基准物质的摩尔质量ismisisisMMMfMmAMmAf24c) 体积校正因子体积校正因子(fv)定义定义 组分含量用体积表示组分含量用体积表示, ,表示单位峰面表示单位峰面积所代表的组分体积积所代表的组分体积。 Vi , Vs表示被测物质、基准物质的体积对于气体样品，其体积校正因子等于摩尔对于气体样品，其体积校正因子等于摩尔校正因子校正因子ssiiVAVAVf25相对响应值相对响应值s相对响应值是物质i与标准物质S的响应值(灵敏度)之比。单位相同时，与校正因子互为倒数与校正因

12、子互为倒数，即：只与试样试样、标准物质标准物质以及检测器类型检测器类型有关，而与操作条件和柱温、载气流速、固定液性质等无关，是一个能通用的常数。 26校正因子的实验测量方法校正因子的实验测量方法 样品的准备样品的准备 测定校正因子时，要精密称定测定校正因子时，要精密称定适量色谱纯的被测组分和基准物质，适量色谱纯的被测组分和基准物质，配制成配制成已知准确浓度的样品已知准确浓度的样品。样品的测定样品的测定 在已确定的色谱条件下，取在已确定的色谱条件下，取准准确体积确体积的样品进样，从谱图上获得的样品进样，从谱图上获得准确的峰准确的峰面积面积。计算计算 根据相对校正因子的计算公式可以算根据相对校正因

13、子的计算公式可以算出质量出质量(或摩尔或体积或摩尔或体积)校正因子。校正因子。27例：某试样含有例：某试样含有5g乙醇，测得相应的色谱峰面积乙醇，测得相应的色谱峰面积为为150mm2，求乙醇的，求乙醇的fi。解：解：22210331505 mmgmmgfi./即每平方毫米色谱峰面积代表即每平方毫米色谱峰面积代表3.310-2g乙醇乙醇 28例：例： 准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯、甲苯、准确称取一定质量的色谱纯对二甲苯、甲苯、苯及仲丁醇，混合后稀释，采用氢焰检测器，定苯及仲丁醇，混合后稀释，采用氢焰检测器，定量进样并测量各物质所对应的峰面积，数据如下：量进样并测量各物质所对应的峰面积，数据如

14、下： 物质物质 苯苯 仲丁醇仲丁醇 甲苯甲苯 对二甲苯对二甲苯 m/g 0.4720 0.6325 0.8149 0.4547 A/cm2 2.60 3.40 4.10 2.20以仲丁醇为标准，计算各物质的相对质量校正因子。以仲丁醇为标准，计算各物质的相对质量校正因子。29 2cm40. 36325. 0gfm 仲丁醇仲丁醇 2cm.10481490gfm 甲苯 061403632501048149022. cmgcmgfffmmm仲丁醇甲苯甲苯 101980. 对二甲苯苯mmff302.4 定量方法定量方法 归一化法归一化法定义定义 把所有出峰的组分含量之和按把所有出峰的组分含量之和按100

15、%计的计的定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。定量方法称为归一化法，是一种相对定量方法。前提前提 样品中的所有组分都能流出色谱柱，而样品中的所有组分都能流出色谱柱，而且在检测器上所有的组分都能产生信号。且在检测器上所有的组分都能产生信号。计算方法计算方法( (加校正因子加校正因子) ) 31优点优点 归一化法很直观，容易接受，计算简便、准确，当操作条件如进样量进样量、流速流速等发生变化时，对计算结果的影响很小，是一种常用的计算方法。缺点缺点 校正因子的测定比较麻烦；必需所有组分校正因子的测定比较麻烦；必需所有组分都出峰都出峰注意注意 主要用于GC的定量测定，当 fi相近时，可直接用峰面积

16、归一化法。 HPLC中较少使用中较少使用(常用检测器为非通用型检测器、不能忽略校正因子) 32 外标法外标法外标法又可分为外标法又可分为标准曲线法标准曲线法和和外标一点法外标一点法，是色谱定量分析中比较常用的一种方法。是色谱定量分析中比较常用的一种方法。属于绝对定量方法。属于绝对定量方法。33标准曲线法标准曲线法 用浓度用浓度峰面积峰面积(峰高峰高)绘制标绘制标准曲线，准曲线，其斜率的倒数即为绝对校正因子其斜率的倒数即为绝对校正因子，标准曲线应该是一条通过原点的直线。标准曲线应该是一条通过原点的直线。 0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0

17、 0 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00 .2 50 .3 00 .0 0 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0M in u te s0 .0 00 .0 50 .1 00 .1 50 .2 00

18、.2 50 .3 00 .0 0 0 .5 0 1 .0 0 1 .5 0 2 .0 0 2 .5 0 3 .0 0 3 .5 0 4 .0 0 4 .5 0 5 .0 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0M in u te s05010015020025001,0002,0003,0004,0005,000样品浓度响应值峰面积()34特点特点适合于大批量样品适合于大批量样品的分析的分析无需各组份都被检出、洗脱无需各组份都被检出、洗脱需要标需要标样样(标准品标准品)标样及样品测定的条件要一致标样及样品测定的条件要一致进样体积要准确进样体积要准确，重复性好重复性好对样品前处

19、理过程中待测组分的变化无法对样品前处理过程中待测组分的变化无法补偿。补偿。35外标一点法外标一点法(单点校正法单点校正法)利用待测组分纯物质配制一个与待测组分含量含量相近相近的标准样(设量为ms)，在同一色谱条件下，分别将相同量的待测组分标样及试样注入色谱仪，出峰后，测量其峰面积(或峰高)，得相应的峰面积As和Ai sisiAAmm ssiimAAm 即：即：36外标一点法的应用前提外标一点法的应用前提方法验证中，标准曲线通过原点配制的标准样含量须与样品中待测组分含量相近称量、配样均需非常准确通常在连续分析大批量样品中使用通常在连续分析大批量样品中使用37 内标法内标法选择适宜的物质作为待测组

20、分的参比物，定量加到样品中去定量加到样品中去，根据待测组分和参比物在检测器上的响应值之比和参比物加入量进行定量分析的方法。38 待测组分待测组分(i)的量的量mi为为：SSSiiiAfmAfm SiiSSiiSiAAfAfAfmm SSiiimAAfm 设样品的总量为设样品的总量为m，则待测组分，则待测组分i的质量分数为的质量分数为%100%100 mAmAfmmwSSiiii39内标法关键内标法关键 选择合适的内标物选择合适的内标物内标物的选择原则内标物的选择原则A. 内标物必须是原样品中内标物必须是原样品中不存在不存在的物质，其性质尽的物质，其性质尽量与待测组分相近量与待测组分相近(同系物

21、、异构体同系物、异构体) ；B. 内标物内标物不能不能和被测组分起化学反应，要能完全溶和被测组分起化学反应，要能完全溶于被测样品中；于被测样品中；C. 内标物的峰尽可能内标物的峰尽可能接近接近待测组分的峰，或位于几待测组分的峰，或位于几个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完个待测组分的中间，但必须和样品中的所有峰完全分离；全分离；D. 内标物的加入量应和待测组分内标物的加入量应和待测组分相近相近。40内标法的特点内标法的特点无归一化法的限制，即只要被测组分能出峰，不和其他峰重叠，不管其他组分是否出峰或是否重叠，都可以用内标法进行定量分析。 定量准确，受操作条件影响较小。可部分补偿待测组分在

22、样品前处理时的损失。若加入几种内标物，还可提高定量分析的精度。缺点缺点 内标物的选择比较困难选择比较困难，同时内标物称量称量要求准确要求准确，操作麻烦。 41 标准加入法标准加入法是一种特殊的内标法 把待测组分的纯物质作为内标物加入到待测样品种在相同的色谱条件下，测定加入待测组分纯物质前、后待测组分的峰面积（或峰高）计算出待测组分在样品中的含量。42具体步骤具体步骤 在确定的色谱条件下，测定样品中待测组分在确定的色谱条件下，测定样品中待测组分(i)的的峰面积或峰高峰面积或峰高Ai(hi); 在第一步所用样品中准确加入已知量为在第一步所用样品中准确加入已知量为Wi的待的待测组分测组分(i)，同样

23、条件下测出峰面积或峰高，同样条件下测出峰面积或峰高Ai(hi)； 根据定量基本公式根据定量基本公式 mi=fiAi(hi)计算计算43mi+mimi mi=fiAi(hi) (前前) mi原样品中待测组分原样品中待测组分(i)的量的量 mi+mi=fi Ai(hi) (后后) fi和和fi是同一组分在加入纯物质前、后两次是同一组分在加入纯物质前、后两次测定的绝对校正因子测定的绝对校正因子,所以有所以有 fi=fi )()(iiiiiiihAhAmmm1)()(ihiAihiAimim44标准加入法的特点标准加入法的特点不需另外的标准物质做内标，仅需有待测组分不需另外的标准物质做内标，仅需有待测

24、组分的纯物质的纯物质 进样量的准确性影响不大，操作简单进样量的准确性影响不大，操作简单 若在样品前处理之前就加入已知准确量的待测若在样品前处理之前就加入已知准确量的待测组分，则可完全补偿待测组分在前处理过程中组分，则可完全补偿待测组分在前处理过程中的损失的损失 要求加入待测组分前后两次色谱测定的色谱条要求加入待测组分前后两次色谱测定的色谱条件完全相同，才能保证两次测定时的校正因子件完全相同，才能保证两次测定时的校正因子完全相等完全相等 45样品制备样品制备 前处理方法，转化率，溶剂，供试液储存前处理方法，转化率，溶剂，供试液储存进样技术进样技术 与外标法关系密切，手动进样，阀进样与外标法关系密切，手动进样，阀进样色谱条件色谱条件 流动相流速，流动相组成，温度，柱效，色谱峰的流动相流速，流动相组成，温度，柱效，色谱峰的对称性对称性检测器性能检测器性能 线性关系，浓度型检测器，质量型监测器，灵敏度线性关系，浓度型检测器，质量型监测器，灵敏度分离度分离度 大则影响小大则影响小2.5