细胞生物学研究方法PPT

1、细细 胞胞 生生 生生 物物 学学 研研 究究 方方 法法第二章第二章班级：09级1班学号：人 生 格 言：既然选择了远方就要风雨兼程！本 章 概 括显微成像技术细胞化学技术细胞分选技术细胞工程技术分离技术分子生物学方法2.1 显显 微微 成成 像像 技技 术术发展史：1590年，年，Z.janssen和他的侄子和他的侄子H.janssen共同研制出最早的光共同研制出最早的光学显微镜。学显微镜。后来，胡克和列文虎克相继提高了光学显微镜的分辨率，观察后来，胡克和列文虎克相继提高了光学显微镜的分辨率，观察到了细胞的结构。到了细胞的结构。2.1.1 光光 学学 和和 电电 子子 显显 微微 镜镜v照

2、明系统照明系统v被观察的样品被观察的样品v聚焦和成像的透镜系统聚焦和成像的透镜系统光学显微镜和电子显微镜的主要区别：光学显微镜和电子显微镜的主要区别：v光源不同光源不同使用的透镜不同使用的透镜不同装置的设计不同装置的设计不同v电子显微镜要在真空电子显微镜要在真空条件下条件下2.1.1.1 分 辨 率 两个物点间最小距离的能力两个物点间最小距离的能力 这种距离成为分辨距离。是透这种距离成为分辨距离。是透镜最重要的性质镜最重要的性质 其中：其中：n=聚光镜和物镜之聚光镜和物镜之间介质的折射率，空气为间介质的折射率，空气为1，油为油为1.5 =样品对物镜孔径角的半角，样品对物镜孔径角的半角， sin

3、 的最大值为的最大值为1=照明光源照明光源的波长的波长 0.61是一个恒定的参数，表是一个恒定的参数，表示成像的点虽被重叠担仍能被示成像的点虽被重叠担仍能被区分的程度区分的程度2.1.1.2分辨极限和放大率最终成像的大小与原物大小的比值称为放大率可见光的波长的限制光学显微镜的最高分辨率2.1.2 常常 见见 的的 光光 学学 显显 微微 镜镜普通双筒显微普通双筒显微 荧光显微镜荧光显微镜相差显微镜相差显微镜暗视野显微镜暗视野显微镜倒置显微镜倒置显微镜偏光显微镜偏光显微镜荧光显微镜荧光显微镜(Fluorescence microscope) 荧光显微镜是以紫外线为光源，荧光显微镜是以紫外线为光源

4、， 用以照射被检物体，用以照射被检物体， 使之发出使之发出荧光，荧光， 然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置。荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。等。倒置显微镜倒置显微镜（inverted microscope ）组成和普通显微镜一样，组成和普通显微镜一样，只不过只不过物镜物镜与与照明照明系统系统颠倒，前者在颠倒，前者在载物台载物台之之下，后者在载物台之上，下，后者在载物台之上，用于观察用于观察培养培养的活的活细胞细胞，具有相差物镜。具有相差物镜。相差显微镜

5、相差显微镜(Phase contrast microscope相差显微镜由相差显微镜由PZernike于于1935年发年发明，并因此获明，并因此获1953年诺贝尔物理学，年诺贝尔物理学，这种显微镜最大的特点是可以观察未这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。经染色的标本和活细胞。 差显微镜具有两个其他显微镜所不具差显微镜具有两个其他显微镜所不具有的功能有的功能:将直射的光将直射的光(视野中背景视野中背景光光)与经物体衍射的光分开与经物体衍射的光分开;将大约将大约一半的波长从相位中除去，使之不能一半的波长从相位中除去，使之不能发生相互作用，从而引起强度的变化。发生相互作用，从而引起

6、强度的变化。暗视野显微镜暗视野显微镜（dark field microscope） 暗视野显微镜又叫暗场显微镜，是一种通过观察样品受侧向光照射时所产生的散射光来分辨样品细节的特殊显微镜。暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动暗视野显微镜主要用于检查未染色标本的形态和运动能力。暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于能力。暗视野显微镜和一般的明视野显微镜区别在于二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗二者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央遮暗的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器的聚光器，使光线不能通过聚光器，而只能从聚光器四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光

7、四周边及未遮暗的部位斜射到载玻片的标本上。因光线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，线是斜射的，不能进入物镜，故观察的视野是暗的，而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌而聚光器斜射到菌体上的光线，因光散射作用而使菌体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到体发出亮光，反射到物镜内，这样在显微镜中可见到暗视野暗视野2.1.3 光学显微镜的样品制备光学显微镜的样品制备样品可粗略的分为两类：整体和切片样品可粗略的分为两类：整体和切片步骤：步骤：1、样品的固定、样品的固定杀死细胞、稳定细胞的化学成分杀死细胞、稳定细胞的化学成分2、包埋和切片、包埋和切片液体的石蜡或树脂做包埋剂，使之

8、渗入整块组织，硬化成固体包液体的石蜡或树脂做包埋剂，使之渗入整块组织，硬化成固体包埋块，然后切割埋块，然后切割3、染色、染色给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征给细胞的不同组分带上可区别的颜色特征2.1.4电子显微镜（电子显微镜（electron microscope） 电子显微镜（电子显微镜（electron microscope），简称电镜，是使用电子来展示物件的），简称电镜，是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。内部或表面的显微镜。1932年，德国学者年，德国学者Knolls和和Ruska发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界。发明了第一台电子显微镜，开拓了超微世界。观察到了亚显微结

9、构，即超微结构。观察到了亚显微结构，即超微结构。到了二十世纪到了二十世纪40年代，美国的年代，美国的希尔希尔用消像散器补偿电子透镜的旋转不对称性，用消像散器补偿电子透镜的旋转不对称性，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代水平。在中国，使电子显微镜的分辨本领有了新的突破，逐步达到了现代水平。在中国，1958年研制成功透射式电子显微镜，其分辨本领为年研制成功透射式电子显微镜，其分辨本领为3纳米，纳米，1979年又制成分辨本领年又制成分辨本领为为0.3纳米的大型电子显微镜。纳米的大型电子显微镜。种类：透射电子显微镜种类：透射电子显微镜 扫描电子显微镜扫描电子显微镜高速的电子的波长比可见

10、光的波长短（高速的电子的波长比可见光的波长短（波粒二象性波粒二象性），而显微镜的分辨率受其），而显微镜的分辨率受其使用的波长的限制，因此电子显微镜的分辨率（约使用的波长的限制，因此电子显微镜的分辨率（约0.2纳米）远高于纳米）远高于光学显微光学显微镜镜的分辨率（约的分辨率（约200纳米纳米扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM ）1938 第一部扫描电子显微镜由第一部扫描电子显微镜由Von Ardenne 发展发展成功。成功。 完全不同于透射电子显微镜的方式成像，即用完全不同于透射电子显微镜的方式成像，即用电视的方式成像。电视的方式成像

11、。扫描电子显微镜主要是利用二次电子扫描电子显微镜主要是利用二次电子信号成像来观察样品的表面形态，即信号成像来观察样品的表面形态，即用极狭窄的电子束去扫描样品，通过用极狭窄的电子束去扫描样品，通过电子束与样品的相互作用产生各种效电子束与样品的相互作用产生各种效应，其中主要是样品的二次电子发射。应，其中主要是样品的二次电子发射。二次电子能够产生样品表面放大的形二次电子能够产生样品表面放大的形貌像，这个像是在样品被扫描时按时貌像，这个像是在样品被扫描时按时序建立起来的，即使用逐点成像的方序建立起来的，即使用逐点成像的方法获得放大像。法获得放大像。射透电子显微镜射透电子显微镜（transmission

12、 electron microscope，TEM）电子显微术的主要电子光学仪器。主体部分电子显微术的主要电子光学仪器。主体部分是是电子透镜和显像记录系统，由置于真空中和显像记录系统，由置于真空中的电子枪、聚光镜、物样室、的电子枪、聚光镜、物样室、 物镜、衍射镜、中间镜、中间镜、 投影镜、荧光屏和投影镜、荧光屏和照相机等等组成。与光学显微镜的结构完全类似（见组成。与光学显微镜的结构完全类似（见图）。透射电子显微镜的工作原理是一单色、图）。透射电子显微镜的工作原理是一单色、单向、均匀而高速的微电子束单向、均匀而高速的微电子束. 这种电镜适用于晶体结构和缺陷的直接这种电镜适用于晶体结构和缺陷的直接成

13、像，即能观测原子或原团的排列成像，即能观测原子或原团的排列,又能确又能确定其所处的空间位置。另一类配有定其所处的空间位置。另一类配有X射线能射线能谱仪、电子能量损失谱仪、俄歇电子谱仪和谱仪、电子能量损失谱仪、俄歇电子谱仪和扫描附件等的分析型电镜，可用于小至直径扫描附件等的分析型电镜，可用于小至直径 4纳米范围内的晶体形态、成分和结构的分纳米范围内的晶体形态、成分和结构的分析。地质学中用于微细矿物，如析。地质学中用于微细矿物，如粘土矿物的的形态观察与鉴定；微细矿物的显微双晶、出形态观察与鉴定；微细矿物的显微双晶、出溶、相变和位错研究等。溶、相变和位错研究等。 2.1.5 电子显微镜的样品制备样品

14、要薄样品要薄;要求很好的保持样品的精细结构要求很好的保持样品的精细结构样品要具有一定的反差样品要具有一定的反差特殊技术特殊技术 负染色负染色喷灌技术喷灌技术冷冻断裂复原和冷冻蚀刻冷冻断裂复原和冷冻蚀刻2.1.6 间接成像技术间接成像技术它作为一种扫描探针显微它作为一种扫描探针显微术工具，扫描隧道显微镜术工具，扫描隧道显微镜可以让科学家观察和定位可以让科学家观察和定位单个原子，它具有比它的单个原子，它具有比它的同类同类原子力显微镜原子力显微镜更加高更加高的分辨率。此外，扫描隧的分辨率。此外，扫描隧道显微镜在低温下（道显微镜在低温下（4K）可以利用探针尖端精确操可以利用探针尖端精确操纵原子，因此它

15、在纵原子，因此它在纳米科纳米科技技既是重要的测量工具又既是重要的测量工具又是加工工具。是加工工具。一种可用来研究包括绝缘体在内的一种可用来研究包括绝缘体在内的固体材料表面结构的分析仪器。它固体材料表面结构的分析仪器。它通过检测待测样品表面和一个微型通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构相互作用力来研究物质的表面结构及性质。及性质。原子力学显微镜原子力学显微镜2.2细胞化学技术2.2.1酶细胞化学技术酶细胞化学技术（enzyme cytochemistry）酶细胞化学技术：酶细胞化学技术： 将细胞内的酶与底物相将细

16、胞内的酶与底物相互作用，互作用， 再将酶反应的产物作为反应物质，再将酶反应的产物作为反应物质，在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下在酶的作用部位进行捕捉，使其在显微镜下具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物，具有可见性。这种在酶作用下产生反应产物， 经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶经捕捉反应来间接证明酶定位的反应称为酶的细胞化学反应。的细胞化学反应。 1、基本原理基本原理 酶的细胞化学反应包括两个反应酶的细胞化学反应包括两个反应: 第一反应是酶作用第一反应是酶作用于底物的反应，于底物的反应， 称酶反应，形成的产物称为初级反应产物称酶反应，形成的产物称为初级反应产物;第二反应是捕捉剂与初

17、级反应产物的作用，称捕捉反应，第二反应是捕捉剂与初级反应产物的作用，称捕捉反应，产生最终反应产物：产生最终反应产物： 酶的细胞化学反应酶的细胞化学反应 酶酶+条件条件 捕捉剂捕捉剂 底物底物初级反应产物初级反应产物 最终反应产物最终反应产物 （酶反应）（酶反应） （捕捉反应）（捕捉反应） 2.2.2 免疫细胞化学技免疫细胞化学技术术利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、荧光素、酶、金属离子、同位素金属离子、同位素) 显色来确定细胞内抗原显色来确定细胞内抗原的成分的成分(主要是多肽和蛋白质主要是

18、多肽和蛋白质)，对其进行定，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学位、定性及定量的研究，称为免疫细胞化学技术。技术。免疫荧光技术免疫荧光技术 将免疫学方法将免疫学方法(抗原抗体特异结合抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。在细胞内分布的方法。 免疫电镜技术免疫电镜技术 免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在免疫电镜技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物，是在超微结构水平研究和观察抗原、结合定位的一种方法学。超微结构水平研究和观察抗原、结合定位的一种方法学。 2.3细胞分选技术概念；概念； 主要用

19、流式细胞仪对细胞或染色体进行分选，并对单个细主要用流式细胞仪对细胞或染色体进行分选，并对单个细胞或其他生物微粒进行定量分析，包括测量细胞的大小、形状、胞或其他生物微粒进行定量分析，包括测量细胞的大小、形状、细胞细胞DNA、RNA含量和细胞总蛋白等。含量和细胞总蛋白等。工作原理工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就

20、能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 2.4 细胞工程技术细胞工程技术概念；概念；细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，改变或创造细胞遗传性的技术。包括体外大量培养和繁殖细胞，或获得细胞产品、或利用细胞体本身

21、。主要内容包括：细胞融合、或获得细胞产品、或利用细胞体本身。主要内容包括：细胞融合、细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及细胞生物反应器、染色体转移、细胞器移植、基因转移、细胞及组织培养。组织培养。 2.4.1 细胞培养细胞培养 (Cellculture ）概念；概念；是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，是指从体内取出组织，经消化酶消化成单细胞或细胞群，模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。使细胞生存和生长并维持其结构和功能的方法。 v体外细胞培养体外细胞培养

22、原代培养原代培原代培养原代培细胞系和细胞株细胞系和细胞株动物细胞培养与植物组织培养的区别动物细胞培养与植物组织培养的区别a.培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基不同：植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）培养基）b.培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植培养基的成分不同：动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。物组织培养则不需要。c.产物不同：植物组织培养最后一般产物不同：植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。不能表达

23、其全能性，因此得到的是同一种的细胞。d.原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动原理不同：植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。物细胞培养的原理为细胞的增殖。2.4.2细胞融合与单克隆抗体细胞融合与单克隆抗体细胞融合细胞融合在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞的过程。质体融合形成一个杂种细胞的过程。细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞融合技术是一种新的获得杂交细胞以改变细胞性能的技术。细胞融合可以在分类学上亲细胞性能的技术。细胞融合可以在分类学上亲缘关系较远的生物之

24、间进行，因此它不但是菌缘关系较远的生物之间进行，因此它不但是菌种改良的一种重要手段，而且是动物或植物品种改良的一种重要手段，而且是动物或植物品种改良的一种有潜力的方法。种改良的一种有潜力的方法。 单克隆技术单克隆技术单可隆抗体是指由一个单可隆抗体是指由一个B细胞克隆产生的可识别的一种抗原表位的细胞克隆产生的可识别的一种抗原表位的同源抗体。基本原理是用小鼠同源抗体。基本原理是用小鼠B淋巴细胞杂交瘤细胞和单克隆技淋巴细胞杂交瘤细胞和单克隆技术。术。 2.4.3 动物细胞核移植克隆技术动物细胞核移植克隆技术多利羊的克隆过程：2.5 分离技术分离技术2.5.1 离心分离技术离心分离技术 借助于离心力，

25、使比重不同的物质进行分离的方法。由于借助于离心力，使比重不同的物质进行分离的方法。由于离心机离心机等设等设备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便备可产生相当高的角速度，使离心力远大于重力，于是溶液中的悬浮物便易于沉淀析出易于沉淀析出:又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度又由于比重不同的物质所受到的离心力不同，从而沉降速度不同，能使比重不同的物质达到分离。不同，能使比重不同的物质达到分离。 有差速离心、密度梯度离心（速度沉降、等密度沉降）有差速离心、密度梯度离心（速度沉降、等密度沉降）2.5.2 层析分离技术层析分离技术层析（层析（chromatogra

26、phy），是根据蛋白质的形态、大小和电），是根据蛋白质的形态、大小和电荷的不同而设计的物理分离方法。荷的不同而设计的物理分离方法。凝胶过滤层析凝胶过滤层析 gel离子交换层析（离子交换层析（Ion Exchange Chromatography简称为简称为IEC） 亲和层析亲和层析(affinity chromatography)2.6 分子生物学方法基因工程技术基因作图与人类基因组计划PCR 技 术选择性基因剔除和转基因鼠乳腺生物反应器技术 2.6.1 基因工程技术基因工程技术定义：定义：基因工程包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构成新的重组的DNA，然后送

27、到受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。2.6.2基因作图和人类基因组计划发展发展：人类基因组计划人类基因组计划(human genome project, HGP)是由是由美国美国科学家于科学家于1985年率先提出，于年率先提出，于1990年正式启动的。美国、英国、年正式启动的。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与了这一价值达这一价值达30亿美元的人类基因组计划。亿美元的人类基因组计划。目标目标：用用15年时间测出年时间测出24条染色体条染色体DNA的全部核苷酸序列，拟阐明人类遗传的

28、全部核苷酸序列，拟阐明人类遗传信息的组成及约信息的组成及约3到到5万个基因的结构和定位。万个基因的结构和定位。人 能 长 生 不 老 吗？内容及意义内容及意义：在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究：在人类基因组计划中，还包括对五种生物基因组的研究：大肠杆菌大肠杆菌、酵母酵母、线虫线虫、果蝇果蝇和和小鼠小鼠，称之为人类的五种，称之为人类的五种“模式生物模式生物”。 HGP的目的是的目的是解码生命解码生命、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认、了解生命的起源、了解生命体生长发育的规律、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿长寿与与衰衰老老等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。等生命现象、为疾病的诊治提供科学依据。 2.6.3 PCR 技技 术术美国科学家美国科学家PE（Perk