化妆品中地索奈德等十一种糖皮质激素的测定液相色谱_串联质谱法编制说明

1、化妆品中地索奈德等十一种糖皮质激素的测定液相色谱 /串联质谱法编制说明（征求意见稿）一、工作简况1 任务来源本项目是根据国标委发 201911 号国家标准化管理委员会关于下达第一批推荐性国家标准计划的通知进行制定，计划编号为20190950-T-469，项目名称为“化妆品中地索奈德等十一种糖皮质激素的测定液相色谱 /串联质谱法” ，主要起草单位有广州质量监督检测研究院等，计划应完成时间为2020 年 12 月。2 主要工作过程（1）起草阶段2019 年 4 月，广州质量监督检测研究院按照全国质量监管重点产品检验方法标准化技术委员会（ SAC/TC374）的要求成立了标准起草工作组，并制订了标准

2、研制计划。2019 年 4 月-2019 年 8 月，标准起草工作组进行了大量的研究分析、资料查证及方法确认等工作，初步设计了实验方案。2019 年 9 月-2020 年 4 月，根据实验方案， 结合实验室大量相关检测数据，重点研究成分复杂的洗面奶类样品的基质效应去除方法，优化确定色谱分离条件和质谱检测条件，优化确定液态水基类、液态油基类、凝胶类、膏霜乳液类等类型化妆品的提取、净化条件，考察方法的灵敏度、准确性、线性范围和适用性，编制标准草案和编制说明，组织3家有资质检测机构对方法进行验证， 提交 SAC/TC374 化妆品检验方法工作二组进行审核，根据审核意见对标准草案进一步修改，形成标准的

3、征求意见稿。（2）征求意见阶段（3）审查阶段（4）报批阶段3 主要参加单位和工作组成员等本标准主要起草单位为广州质量监督检测研究院等。工作组主要成员：×××。1二、标准编制原则和主要内容（一）标准编制原则本标准的制定符合产业发展的原则。本着先进性、科学性、合理性和可操作性的原则，以及标准的目标、统一性、协调性、适用性、一致性和规范性原则来进行本标准的制定工作。本标准是按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则和 GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准的要求编写的。本标准的重复性和再现

4、性按 GB/T 6379.1-2004测量方法与结果的准确度 （正确度与精密度）第 1 部分：总则与定义和 GB/T 6379.2-2004测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第 2 部分：确定标准测量方法的重复性和再现性的基本方法进行确定。（二）标准研制背景对我国现行糖皮质激素药物的检测方法标准以及科技文献资料进行调研，发现近年来关于糖皮质激素药物的检测方法主要有液相色谱法及液相色谱/串联质谱法等，主要应用于化妆品、食品领域的相关检测。其中液相色谱/串联质谱法是我国GB/T 24800.2-2009化妆品中四十一种糖皮质激素的测定液相色谱 /串联质谱法和薄层层析法、SN/T2533-20

5、10进出口化妆品中糖皮质激素类与孕激素类检测方法、SN/T 4504-2016出口化妆品中氯倍他索、倍氯米松、氯倍他索丙酸酯的测定液相色谱 -质谱 /质谱法、国家食品药品监督管理总局关于发布面膜类化妆品中氟轻松检测方法的通告（2016 年第 88号） 附件：面膜类化妆品中氟轻松检测方法（高效液相色谱 -串联质谱法）采用的标准方法。以上四个方法标准共涉及 44 种糖皮质激素，然而，随着国家对标准涉及糖皮质激素的监管力度不断加大，不法企业为了使产品具有明显短期功效的同时又能规避市场监管，近年来开始通过化学合成设计等手段，将某些功效较好的糖皮质激素进行结构修饰，合成新型糖皮质激素，掺入化妆品原料中生

6、产使用，对消费者的合法权益和健康造成了一定危害。广州质量监督检测研究院多年来通过采用液相色谱 -四极杆串联飞行时间质谱技术不断深入对化妆品中糖皮质激素类物质的筛查研究。通过质谱解析，筛查并鉴定出实际化妆品中地索奈德等 11 种现有标准方法外的糖皮质激素。综上可见，现行的检测方法标准已无法全面覆盖时下不法企业可能添加的糖皮质激素种类，因此，针对地索奈德等11 种已在实际化妆品中检出的新型糖皮质激素（其中 3 种已新增至国家药监局2019 年第66 号文件所发布的“化妆品中激素类成分的检测方法”中）建立检测方法，可有效补充2现行检测方法标准覆盖范围不能满足市场监管的不足，为强化化妆品的安全监管提供

7、有力的技术支撑。（三）主要内容本标准规定了化妆品中地索奈德、16-羟基泼尼松龙、 16-羟基泼尼松龙醋酸酯、二氟拉松、氟轻松、去羟米松、帕拉米松醋酸酯、地索奈德-21-醋酸酯、甲基泼尼松龙醋酸丙酸酯、卤倍他索丙酸酯和倍他米松丁酸丙酸酯11 种糖皮质激素的液相色谱/串联质谱（ LC-MS/MS ）测定方法。本标准适用于化妆品中地索奈德等11 种糖皮质激素的测定。1 前处理条件的优化1.1 精油类化妆品前处理条件的优化精油类样品不能很好分散于极性提取剂中，因此采用正己烷分散后再用极性溶剂进行提取的方法。对比了 80%乙腈水溶液、 70%乙腈水溶液、 50%乙腈水溶液三种提取剂对精油样品中 11 种

8、糖皮质激素的提取效果。具体试验方法为：称取 0.2 g 样品于 10 mL 塑料离心管中（制备平行样品），加入标准溶液至加标浓度为 0.2 g/g，混匀。加入 2 mL 正己烷，涡旋分散均匀后，加入 3 mL 提取剂，涡旋振荡 2 min，以 10 000 r/min 离心 5 min，吸出下层溶液至 10 mL 比色管中， 上层正己烷用 3 mL 提取剂重复提取一次，合并两次提取液，加 50%乙腈水溶液定容至刻度，混匀，取适量溶液经 0.22 m有机滤膜过滤，待测定。试验结果显示， 70%乙腈水溶液对精油样品中 11 种糖皮质激素的提取效果较佳，加标回收率在 80%120%之间，采用其他两种

9、提取剂时，个别糖皮质激素的加标回收率低于 75%。综上，对于精油样品，采用正己烷分散后，70%乙腈水溶液提取的方式进行前处理。1.2 其他类化妆品前处理条件的优化化妆品成分复杂多样，采用LC-MS/MS 法测定时可能因基质效应影响分析准确性，因此可以通过优化前处理条件以尽可能去除基质干扰。本标准通过样品加标试验对比了三种前处理方法（ 甲醇直接提取法， 饱和食盐水分散、乙腈提取法，HLB 固相萃取小柱净化法）对4 类典型化妆品（水剂、乳液、膏霜、洗面奶）中11 种糖皮质激素的提取效果。具体加标试验前处理方法如下：甲醇直接提取法：称取0.5 g 样品于 10 mL 比色管中（制备平行样品），加入标

10、准3溶液至加标浓度为 0.2 g/g，混匀。加入少许甲醇， 涡旋混匀，然后用甲醇定容至 10 mL，涡旋 30 s，超声提取 20 min，涡旋 1 min。必要时离心，取上清液经 0.22 m有机滤膜过滤至进样小瓶，待测。饱和食盐水分散、 乙腈提取法：称取 0.5 g 样品于 10 mL 比色管中（制备平行样品），加入标准溶液至加标浓度为 0.2 g/g，混匀。加入 1 mL 饱和氯化钠溶液，涡旋 30s，然后加入乙腈并定容至 10 mL ，涡旋 30 s，超声提取 20 min，涡旋 1 min，必要时离心，取上清液经 0.22 m有机滤膜过滤至进样小瓶，待测。 HLB 固相萃取小柱净化法

11、：称取 0.2 g 样品于 10 mL 塑料离心管中（制备平行样品），加入标准溶液至加标浓度为 0.2 g/g，混匀。按照 GB/T 24800.2-2009 中前处理方法进行提取和 HLB 固相萃取小柱净化（具体处理过程为：加入 3 mL 饱和氯化钠溶液分散，然后加入 2 mL 乙腈，充分涡旋提取 2 min，离心；吸出上层清液于 50 mL 塑料离心管中，下层氯化钠溶液用 2 mL 乙腈重复提取一次， 合并上清液； 然后往提取液中加入 40 mL 高纯水，混匀，加入 0.2 mL 亚铁氰化钾溶液， 混匀，加入 0.2 mL 乙酸锌溶液， 混匀，离心；上清液进行 HLB 固相萃取小柱净化，

12、10%乙腈水溶液淋洗， 用 4 mL 甲醇洗脱至 10mL 比色管中，甲醇定容至 5mL，取适量试液经 0.22 m有机滤膜过滤至进样小瓶，待测。试验结果显示，对于水剂、乳液、膏霜、洗面奶化妆品，采用以上三种方法进行前处理，以溶剂校准曲线法定量时，大部分样品都存在明显的基质抑制，导致多个糖皮质激素的回收率低于70%。方法采用了 HLB 柱进行净化，可改善其中少部分糖皮质激素的基质抑制情况，但仍有多种糖皮质激素的加标回收率低于 70%（特别是对于洗面奶产品），不能达到分析方法要求。基于上述试验结果，因此本研究拟从以下两方面对样品前处理进行进一步优化：a）对于水剂、乳液、膏霜类样品，拟采用溶剂直接

13、提取法，以基质校准曲线定量，下一步将优化提取溶剂类型；b）对于洗面奶类样品，拟继续优化固相萃取净化方法，以进一步降低基质效应。水剂、乳液、膏霜类化妆品提取剂的选择相对于水剂和乳液样品，膏霜样品成分更为复杂，因此选取膏霜类样品作为代表性样品，对比研究了 8 种不同提取剂（甲醇、 80%甲醇水溶液、 50%甲醇水溶液、 20%甲醇水溶液、乙腈、 80%乙腈水溶液、 50%乙腈水溶液、 20%乙腈水溶液）对 11 种糖皮质激素的提取效果。4具体试验方法为：称取0.5 g 样品于 10 mL 比色管中（制备平行样品），加入标准溶液至加标浓度为0.2 g/g，混匀。加入少许提取剂，涡旋混匀，用提取剂定容

14、至10 mL ，涡旋 30 s，超声提取 20 min，涡旋 1 min。必要时离心，取上清液经0.22 m有机滤膜过滤至进样小瓶，待LC -MS/MS 测定。试验结果显示，采用20%甲醇水溶液和20%乙腈水溶液作为提取剂，膏霜样品中部分糖皮质激素提取效果较差，采用其余6 种提取剂对所有目标物均能得到良好提取效果，且加标回收率相差不大（以基质校准曲线定量），考虑到乙腈提取液中杂质较少，且较容易过滤，因此选取乙腈作为水剂、乳液、膏霜类化妆品的提取剂。离子交换固相萃取柱对洗面奶样品的净化效果洗面奶样品中含有较高含量的表面活性剂，在进行LC -MS/MS 分析时可能产生较强的基质效应，影响分析准确性

15、。表面活性剂按照极性基团的解离性质可分为阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂四类。因此，对比研究了弱阴离子交换固相萃取小柱（Waters Oasis WAX，500 mg/6 cc）、强阴离子交换固相萃取小柱（ Waters Oasis MAX，500 mg/6 cc）、弱阳离子交换固相萃取小柱（ Waters Oasis WCX，500 mg/6 cc）三种不同类型小柱对洗面奶样品中基质干扰的去除效果。具体试验方法为：称取0.2 g 样品至 10 mL 比色管中（制备平行样品），加入标准溶液至加标浓度为0.25 g/g，混匀。加入少许甲醇涡旋分散，

16、然后用甲醇定容至5 mL ，涡旋 30 s，超声 20 min。取约 1 mL 样液过 0.22 m有机滤膜至进样小瓶， 得甲醇提取试液。另取样液 2 mL 加入已活化好的固相萃取小柱中（具体操作按说明书进行），用氮吹管接取流出液，用 5 mL 甲醇洗脱，收集所有流出液， 氮吹至近干， 2 mL 甲醇复溶，过 0.22 m 有机滤膜至进样小瓶，得净化试液。采用 LC -MS/MS 对标准溶液和样品试液进行测定， 结果显示（见表 1），采用 WAX 、MAX柱仅能改善个别糖皮质激素的基质效应，WCX 净化处理后试液中各糖皮质激素的基质效应情况与甲醇提取试液中基本一致。采用三种固相萃取净化方式均不

17、能得到满意的加标回收率，基质效应的影响未能降低到满意结果。5表 1 WAX 、 MAX 、 WCX 小柱对洗面奶中11 种糖皮质激素的回收率结果化合物回收率（ %） *WAXMAXWCX甲醇提取16-羟基泼尼松龙7971727916-羟基泼尼松龙醋酸酯34425546二氟拉松90818195地索奈德40403843氟轻松80777781去羟米松87798390帕拉米松醋酸酯52556662地索奈德 - 21-醋酸酯5042杂质干扰导致无杂质干扰导致法定量无法定量甲基泼尼松龙醋酸丙酸酯40445048卤倍他索丙酸酯31292828倍他米松丁酸丙酸酯38373738注 * ：进行回收率测试的样品为

18、品牌1 洗面奶。TPZ200116-4516MET02-neg1001: TOF MS ES-A7.43TIC5.741.28e58.01%6.53 6.718.934.265.919.6310.430.80 0.869.953.003.27 3.635.1611.2814.2201.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00200116-4516WCXJB102-neg1: TOF MS ES-1007.43TICB5.741.23e57.99%6.51 6.728.910.844.299.631

19、0.423.003.29 3.639.9311.255.1414.1902.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.001.00200116-4516MAXJB102-neg1: TOF MS ES-100C5.74TIC9.16e47.99%7.439.630.8410.312.983.276.337.308.739.961.132.064.608.3811.2814.2214.9901.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.001

20、5.0016.00200116-4516WAXJB102-neg1: TOF MS ES-1005.767.45TICD1.10e58.01%8.939.634.290.861.132.986.35 6.729.9610.4211.283.278.3814.2601.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00200116-STD_500B03-neg1: TOF MS ES-10014.99TIC12.23 12.356.57e3E12.0712.8113.5114.4410.4511.4113.8

21、7%4.525.117.427.788.599.4411.022.657.9610.090.894.050Time1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00图 1Q-TOF 负离子模式全扫描总离子流色谱图（A ：甲醇提取； B ： WCX 小柱净化； C： MAX小柱净化； D： WAX 小柱净化； E： 11 种糖皮质激素标准溶液，浓度为0.5 mg/L ）6进一步采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF）对标准溶液和样品试液进行负离子模式全扫描分析，结果如图1 所示

22、。由图可看出， WCX 净化试液的 TIC 图与甲醇提取试液的基本一致， 说明采用 WCX 净化的效果不明显； WAX 、MAX净化试液的TIC 图中，某些杂质峰的响应值明显较甲醇提取试液中相应峰的响应低，且MAX 净化试液中更明显，说明采用WAX 、MAX 净化可降低部分基质干扰，且MAX 的净化效果优于 WAX 。不同上样量对洗面奶净化效果的影响根据上述研究结果， MAX 柱虽然能降低部分基质干扰的质谱响应，但未能明显改善基质抑制。推测可能是因为样品中表面活性剂含量较高，样液上样量过大，超出固相萃取小柱的柱容量， 导致基质效应不能有效去除。 因此，进一步对比研究了降低上样量 （0.5mL、

23、 1 mL，具体试验方法同，最后分别用与上样量等体积甲醇复溶）的净化效果。结果显示（见表 2），减少上样量未能有效改善基质效应，多个糖皮质激素的回收率低于70%。表 2 MAX 小柱不同上样量对洗面奶中11 种糖皮质激素的回收率结果化合物回收率（ %） *0.5 mL1 mL甲醇提取16-羟基泼尼松龙72737816-羟基泼尼松龙醋酸酯424048二氟拉松919599地索奈德564748氟轻松808084去羟米松888994帕拉米松醋酸酯626267地索奈德 -21-醋酸酯5659杂质干扰导致无法定量甲基泼尼松龙醋酸丙酸酯484850卤倍他索丙酸酯343234倍他米松丁酸丙酸酯353138注

24、* ：进行回收率测试的样品为品牌1 洗面奶。进一步采用 UPLC-Q-TOF 法对不同上样量的样品试液进行正离子模式全扫描分析，结果如图 2 所示。从图中可见，随着上样量降低至0.5 mL 时，虽然部分杂质响应明显降低，但仍然很高，且与目标物共流出，抑制目标物的响应，不能达到满意的基质效应去除效果。7200205-4516-MET1: TOF MS ES+1004.895.02TIC5.62e5%0.580.806.246.578.05 8.117.558.992.325.7111.5211.9812.543.869.6013.0201.002.003.004.005.006.007.008.

25、009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00200205-4516-MAX 21: TOF MS ES+1004.915.06TIC5.05e5%0.578.050.812.335.386.298.9911.5112.343.895.717.299.68TPZ 01: TOF MS ES+200205-4516-MET2.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.001.0016.0017.00TIC200205-4516-MAX 1-5A4.895.021: TOF MS

26、 ES+1005.62e51004.965.088.058.11TIC%0.580.806.246.574.53e57.55 7.988.098.99%0.572.325.7111.5212.540.803.866.289.6011.9813.025.4202.333.899.0011.505.717.269.7112.9801.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.00200205-4516-MAX 22.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.001

27、2.0013.0014.0015.001: TOF MS ES+1.0016.0017.00TIC20021005-4516-MAX 14.915.061: TOF MS ES+5.05e5100B4.965.078.05TIC%0.570.814.02e52.335.386.298.008.098.9911.51%0.570.813.894.835.445.716.287.2912.349.6810.8102.363.915.717.349.0311.4713.001.003.007.008.009.6310.0011.0012.0014.0015.0016.0017.0002.004.00

28、5.006.009.0013.001: TOF MS ES+200205-4516-MAX 1-52.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.001001.0016.0017.00TIC4.965.08200205-4516-MAX 0-51: TOF MS ES+5.144.53e5100C4.99TIC0.575.207.988.092.45e5%0.816.285.429.000.80%0.572.333.895.475.71 6.317.268.059.7111.5012.982.353.936.4011.82

29、05.777.299.5114.431.002.003.004.005.007.008.0010.0011.0012.0013.0015.0016.0017.0006.009.0014.001: TOF MS ES+200205-4516-MAX 12.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.001.0016.0017.00TIC1004.965.07200205-TPZ_11S_1P011: TOF MS ES+4.02e51000.570.815.448.008.0911.0011.4711.7411.8814.4

30、514.60TIC%D6.2812.367.34e43.914.837.349.0310.3210.6811.4712.8814.29%2.365.719.689.6310.8113.0001.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.0017.000Time200205-4516-MAX 0-52.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.001: TOF MS ES+1001.004.9916.0017.00TIC5.14 5

31、.200.812.45e50.572.35图 28.05%Q-TOF6.31正离子模式6.40全扫描总离子流色谱图3.935.477.2911.825.779.5114.430（ A ：1.00甲醇提2.00取；3.00B ：14.00mL 上5.00样体积6.00；100 浓度为 1.0 mg/L ）%0柱容量1.00对洗2.面00奶净3.00化效4.00果的5.影00响6.00C： 0.5 mL 上样体积；D ：11 种糖皮质激素标准溶液，17.007.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.001: TOF MS ES+11.4711.74

32、11.8812.3614.4514.60TIC11.007.34e410.6812.8814.299.6810.327.008.009.0010.0011.0012.0013.0014.0015.0016.00Time17.00根据上述研究结果， 降低上样量可有效降低杂质响应。考虑到所使用的MAX 柱的柱容量较小（0.25 meq/g），因此进一步考察了柱容量较高的强阴离子交换固相萃取小柱SAX（ phenomenon，500 mg/3 cc，柱容量 0.78 meq/g）对洗面奶样品中的杂质干扰去除效果，同时也考察了不同上样量（ 0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL ）的影响。具体试验方法为：称取 0.2 g 样品（制备平行样品），甲醇定容至 5 mL，加入标准溶液至加标浓度为 2.5 g/g，超声提取 20 min，离心，取约 1mL 溶液过 0.22 m有机滤膜至进样小瓶，得甲醇提取