二代测序技术在医学领域中的应用

1、会计学1二代测序技术在医学领域中的应用二代测序技术在医学领域中的应用第1页/共74页第2页/共74页第3页/共74页第4页/共74页第5页/共74页第6页/共74页第7页/共74页第8页/共74页第9页/共74页第10页/共74页第11页/共74页第12页/共74页第13页/共74页Flowcell第14页/共74页第15页/共74页可同时运行2张8通道flowcell有高通量模式和快速模式2种模式。单次运行数据量高达500GB。快速模式最短运行时间17小时。第16页/共74页第17页/共74页第18页/共74页第19页/共74页第20页/共74页第21页/共74页第22页/共74页第23页/

2、共74页第24页/共74页示例示例第25页/共74页第26页/共74页第27页/共74页第28页/共74页克服了核酸量不够的问题。n在本案例中，钩端螺旋体DNA只占总DNA的万分之0.6，含量极微，但经过高通量测序，得到了475条钩端螺旋体的DNA，这让钩端螺旋体无处循形。第29页/共74页2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以

3、快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda, M., Katano, H., Nakajima, N., Tobiume, M., Ainai, A., Sekizuka, T., Sata, T. (2010). PloS One, 5(4), e10256. doi:10.1371/journal.pone.0010256第30页/共74页第31页/共74页第32页/共74页第33页/共74页第34页/共74页第35页/共74页第36页/共74页有关有关lncRNA的一些知的一些知识：识：长度大于200bp无法编码蛋白有内含子区和外显子区非编码RNA具有调节基因表达的作用，如对染色体

4、结构的影响，对RNA加工修饰及稳定性的影响，对转录和翻译的影响，甚至对蛋白质的转运及稳定性都有一定的影响。所以近年来，许多通过RNA-seq进行测序分析的文章都包括对lncRNA的分析，并且发现了许多新的lncRNA。第37页/共74页第38页/共74页sRNA-Seq第39页/共74页n通量高，成本比Tilling array或者大规模的EST测序要低。第40页/共74页公式直接计算。第41页/共74页第42页/共74页石蜡包埋技术（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded, FFPE）是现今临床上最常见的保存DNA方法，全球医院的珍贵临床样本中超过80%都使

5、用该技术保存，但由于该技术DNA经过福尔马林浸泡，使DNA分子发生交联和酶修饰，导致DNA存在不同幅度的降解。第43页/共74页第44页/共74页第45页/共74页第46页/共74页第47页/共74页第48页/共74页第49页/共74页第50页/共74页第51页/共74页CTCs研究研究意意义义深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制进一步了解 ， 为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据 CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移有助于评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略第52页/共74页CTCs研究研究难难点点CTCs并没有显著的特异性同其它血细胞明确区

6、分且不同组织学类型和分子表型的肿瘤分别表达不同的标志物。CTCs在外周血中数量稀少，一般在106-107个白细胞中仅含有1个。无显著特异性数量少第53页/共74页CTCs的富集的富集非特异性富集方法特异性富集方法方法CTCs-芯片富集法纳米粒富集法免疫磁珠富集法密度梯度离心富集法细胞大小 富集法细胞变形性富集法细胞电学特征富集法Ficoll法和Oncoquick法上皮肿瘤细胞大小分离(ISET)和微滤芯片技术双向电泳-场流分离法（DEP-FFF）磁性活细胞分选法(MACS)、 AdnaTest法、 Cellsearch法第54页/共74页通过细胞形态通过细胞形态富集富集第55页/共74页微流芯

7、片微流芯片第56页/共74页密度梯度密度梯度离心离心Plasma:血浆血浆Mononuclear cell：单核细胞（包括：单核细胞（包括淋巴细胞、淋巴细胞、 单核细单核细胞、胞、 上皮细胞和肿上皮细胞和肿瘤瘤细胞）细胞）Ficoll：密度梯度液：密度梯度液RBCs：红细胞：红细胞第57页/共74页免疫免疫磁珠磁珠富集法富集法第58页/共74页微流体微流体第59页/共74页CTCs鉴定鉴定流式细胞仪分析(flow cytometry FCM)免疫细胞化学技术 ICC（immunocytochemistry）鉴定标本中细胞抗原性和形态学特征，能使富集的目的细胞维持细胞形态并保持细胞活力 ICC是

8、用能与显色剂结合的单抗与 CTCs特异性结合后，通过显色剂显色从而对CTCs进行鉴定的技术通过分析上皮细胞或肿瘤细胞的正常起源组织特异的候选基因的表达来检测 CTC, 灵敏度非常高但是坏死的癌细胞、上皮细胞污染等都可以造成假阳性结果，此法无法检测CTCs细胞形态，在临床应用上有局限性。反转录-聚合酶链反应RT-PCR第60页/共74页CTCs与与NGS的的结合结合第61页/共74页第62页/共74页ctDNA与与NGS的的结合结合第63页/共74页CTCsctDNA仪器需求需特殊仪器无需特殊仪器，只需全血样本分离需特殊仪器分离无需特殊仪器，只需提取cfDNAWGA分析可做不可做检测精度高高深度

9、测序下才可达到较高精度有创/无创 无创无创是否可做组织特异性可以不可，任何细胞都会代谢产生cfDNA第64页/共74页谢谢！第65页/共74页第66页/共74页第67页/共74页第68页/共74页2009年H1N1病毒爆发感染时，有一名病人死于呼吸系统引起的多器官衰竭，然而并不知道具体的死因。科学家把病人的肺部穿刺组织的DNA拿来做高通量测序。最终在950万条序列中，含有0.85%的序列来自于H1N1病毒基因组，从而帮助科学家发现了该病人的真正死因。在这样高人类基因组干扰的背景下，目前其他技术都难以快速发现致病病毒序列、以及分子分型。Kuroda, M., Katano, H., Nakajima, N., Tobiume, M.,