现代分离方法与技术 制备色谱技术PPT学习教案

1、会计学1制备色谱技术设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及设备简单，操作方便、分离快速、灵敏度及分辨率高；分辨率高；a. 切割谱带更加方便；切割谱带更加方便；b. 自动化：自动点样仪、自动程序展开仪自动化：自动点样仪、自动程序展开仪、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多、薄层扫描仪、多种强制流动技术、多种联用技术如傅立叶变换红外、拉曼、种联用技术如傅立叶变换红外、拉曼、质谱等。质谱等。第1页/共284页制备色谱技术常规制备薄层色谱常规制备薄层色谱PTLCPTLC薄层板制备薄层板制备 为了增大上样量，增加了吸附剂用量。为了增大上样量，增加了吸附剂用量。固定相固定相：硅胶、氧化铝、纤维素、：硅胶、氧化

2、铝、纤维素、C2C2、C18C18等反相健合硅胶等反相健合硅胶支撑支撑：玻璃板或铝箔：玻璃板或铝箔平均平均25 m, 540 m硅胶硅胶H、硅胶、硅胶G、硅胶、硅胶F254、硅胶、硅胶F365、硅胶、硅胶P第2页/共284页制备色谱技术制备色谱技术硅胶粒径范围影响：硅胶粒径范围影响：1. 越细越均匀，分离度越高，越细越均匀，分离度越高，但流速？但流速？2. 粒径范围宽，分离效率低，粒径范围宽，分离效率低，怎么办？怎么办？-薄层厚度的渐变薄层厚度的渐变薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。薄层厚度从底部到前沿逐渐增加，这样展开剂的

3、速度逐渐变慢，样品谱带在展开过程中逐步富集，可保持较窄的谱带。第3页/共284页制备色谱技术薄层板的制作方法：薄层板的制作方法： 常采用常采用湿法湿法：平铺法平铺法和和涂铺法涂铺法。混合混合平铺平铺涂铺器涂铺器自然干燥一夜自然干燥一夜105-120活化活化黏合剂黏合剂硅胶硅胶煅石膏煅石膏或羧甲基纤维素钠水溶液或羧甲基纤维素钠水溶液第4页/共284页制备色谱技术薄层色谱条件选择操作参数操作参数流速流速展开模式展开模式分离距离分离距离样品量样品量流动相流动相选择性选择性溶剂强度溶剂强度黏度黏度展开缸类型展开缸类型薄层板和薄层板和展开缸空展开缸空腔体积比腔体积比值值温度温度蒸气相蒸气相固定相固定相薄

4、层厚度薄层厚度颗粒大小颗粒大小质量质量开放型开放型操作不连续操作不连续第5页/共284页第6页/共284页 原位反应法原位反应法第7页/共284页第8页/共284页XXXd1d2D第9页/共284页第10页/共284页常用溶剂常用溶剂(1)(1)电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；电子接受体溶剂：苯、甲苯、乙酸乙酯、丙酮等；(2)(2)质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等；质子给体溶剂：异丙醇、正丁醇、甲醇、无水乙醇等；(3)(3)强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；强质子给体溶剂：氯仿、冰醋酸、甲酸、水等；(4)(4)质子受体溶剂：三乙胺、乙醚等；质子受体溶剂：三乙胺

5、、乙醚等；(5)(5)偶极作用溶剂：二氯甲烷偶极作用溶剂：二氯甲烷(6)(6)惰性溶剂：环己烷、正己烷等。惰性溶剂：环己烷、正己烷等。制备色谱技术溶剂的极性大小顺序：溶剂的极性大小顺序： 水甲酸水甲酸 二甲基亚砜二甲基亚砜 甲醇甲醇 乙醇乙醇 正丙醇丙酮正丙醇丙酮 乙乙酸酸 乙酸乙酯乙酸乙酯 蓖麻油乙醚氯仿蓖麻油乙醚氯仿 植物油四氯化碳植物油四氯化碳 液体石蜡。液体石蜡。第11页/共284页第12页/共284页第13页/共284页第14页/共284页第15页/共284页第16页/共284页第17页/共284页第18页/共284页第19页/共284页固定相固定相展开剂展开剂样品样品亲脂性失活性亲

6、水性非极性极性活性亲脂性亲水性非极性极性亲脂性亲水性色谱分配条件的选择(a)(b)吸附色谱分配色谱Rf = 0.20.8第20页/共284页通过比较就可以找通过比较就可以找到最合适的展开剂到最合适的展开剂和吸附剂。和吸附剂。2.5 cm己烷四氯化碳苯二氯甲烷氯仿-乙醇（99: 1）洗脱强度递增点滴实验法第21页/共284页制备色谱技术上样和展开上样和展开1.先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；先用甲醇展开一次，除去可能存在的杂质；2.低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。低挥发性溶剂溶解样品会引起样品带变宽，因此选用挥发性

7、溶剂（己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等），且溶剂极性尽可能小。3.样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，样品浓度以能均匀分布于吸附剂表面不析出为宜，5-10%；4.带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方带状点样，尽可能窄；如点样带太宽，可用高极性溶剂展开至点样带上方2 cm处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。处进行浓缩，然后将铺板干燥后再用展开剂展开。？第22页/共284页制备色谱技术样品检测样品检测a. 有色物质直接观察斑点；有色物质直接观察斑点；b. 荧光物质在紫外灯下观察；荧光物质在紫外灯下观察；c.无色无荧光可在荧光板分离，紫外光下无色无荧光可在荧光板

8、分离，紫外光下显示暗斑；显示暗斑；d. 喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可喷显色剂，结构稳定且不易氧化物质可以用碘蒸气显色，可逆；以用碘蒸气显色，可逆；第23页/共284页制备色谱技术常用显色剂：常用显色剂：a. 硫酸：硫酸硫酸：硫酸:乙醇乙醇(1:1)溶液，喷后溶液，喷后110烤烤5分钟，不同有机物显不同的颜色；分钟，不同有机物显不同的颜色；b. 0.05%高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，高锰酸钾溶液，还原性物质显黄色，背景淡红色；背景淡红色；c.酸性重铬酸钾：酸性重铬酸钾：5%重铬酸钾浓硫酸溶液，重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时必要时150烤薄层；烤薄层；d. 5%磷钼酸乙醇溶液：喷后磷钼酸乙醇

9、溶液：喷后120烤，还原性烤，还原性物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。物质显蓝色，再用氨气熏，背景无色。第24页/共284页制备色谱技术样品收集：样品收集：a. 切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器切割：刮刀或与真空相连的管型刮离器；b. 回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常回收：极性尽可能低的溶剂洗脱，通常1 g吸附剂用吸附剂用5 mL溶剂，丙酮和氯仿常用，溶剂，丙酮和氯仿常用，甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常甲醇因溶解硅胶及其中含有的杂质不常用。用。c.4型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用型玻璃沙芯漏斗过滤洗脱液，再用0.2-0.45 m滤膜过滤。滤膜过滤。d. 硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质

10、，硅胶的黏合剂以及荧光指示剂等杂质，可用可用Sephadex LH-20过滤纯化。过滤纯化。第25页/共284页制备色谱技术常规制备TLC速度慢，效率低，如何提高？加压离心第26页/共284页加压制备加压制备OPLC 弹性气垫，外压使没有气相存在，展开弹性气垫，外压使没有气相存在，展开剂强制流动，展开速度加快剂强制流动，展开速度加快制备色谱技术更细的固定相颗粒、更长的薄层板更细的固定相颗粒、更长的薄层板第27页/共284页离心制备离心制备CTLC 离心力加速流动相，分离速度快，操作简单，占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯度洗脱，进样量大，一次分离量离心力加速流动相，分离速度快，操作简

11、单，占用空间小，使用溶剂少，可反复使用，可进行梯度洗脱，进样量大，一次分离量0.1-0.2 g.制备色谱技术第28页/共284页不同制备TLC方法的比较 制备色谱技术参数参数PTLCOPLCCTLC流动相迁移方法流动相迁移方法毛细作用毛细作用加压加压离心离心薄层厚度薄层厚度/mm0.5-20.5-21-4分离长度分离长度/cm181812分离模式分离模式线形线形线形线形环形环形组分分开方法组分分开方法离线离线在线在线在线在线典型上样量典型上样量/mg50-15050-30050-500分离谱带数分离谱带数2-52-72-12第29页/共284页n 可使用较大直径的色谱柱，更多的固定相可使用较大

12、直径的色谱柱，更多的固定相，因此样品量可以更大；，因此样品量可以更大；n 分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；分离速度较慢，样品可能被不可逆吸附；n 不适合小颗粒的吸附剂？不适合小颗粒的吸附剂？n 改进方法：减压、加压等改进方法：减压、加压等制备色谱技术第30页/共284页柱色谱常用固定相柱色谱常用固定相(1)硅胶：硅胶：官能团和分子的几何形状，对异构官能团和分子的几何形状，对异构体的分离选择性远大于其他色谱方法。体的分离选择性远大于其他色谱方法。烷基烷基 卤素（卤素（F Cl Br I） 醚醚 硝基混合物硝基混合物 腈腈 叔胺叔胺 酯酯 酮酮 醛醛 醇醇 酚酚 伯胺伯胺 酰胺酰胺 羧酸羧酸

13、磺酸磺酸掺杂硅胶：掺杂硅胶：如硝酸银处理，对不饱和烃有好如硝酸银处理，对不饱和烃有好的分离效果。的分离效果。1%-10%的添加剂的水或丙酮的添加剂的水或丙酮溶液与硅胶混合，稍干后溶液与硅胶混合，稍干后110干燥即可。干燥即可。制备色谱技术第31页/共284页(2) 健合硅胶健合硅胶SiOH+ROHSiORSiOH+SOCl2SiClSiCl+RNH2SiNHRSiCl+RXMgSiRSiOH+R3SiXSiOSiRRR制备色谱技术第32页/共284页(3) 氧化铝氧化铝碱性氧化铝碱性氧化铝：其水提取液为其水提取液为pH9-10，常用于碳氢化合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。，常用于碳氢

14、化合物的分离，从碳氢化合物中除去含氧化合物。中性氧化铝中性氧化铝：5%乙酸处理，水提取液为乙酸处理，水提取液为pH7.5，适用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成分如酯、内酯等化合物的分离。，适用于醛、酮、醌、某些苷以及酸碱溶液中不稳定成分如酯、内酯等化合物的分离。酸性氧化铝酸性氧化铝：2MHCl溶液处理，水提取液溶液处理，水提取液pH为为4-4.5，适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。，适合于天然及合成酸性色素以及某些醛、酸的分离。制备色谱技术第33页/共284页(4) 活性炭活性炭：分离水溶性物质分离水溶性物质n 吸附作用在水溶液中最强，用有机溶剂洗吸附作用在水溶液中最强，

15、用有机溶剂洗脱。脱。n 对芳香族的吸附力大于脂肪族；对芳香族的吸附力大于脂肪族；n 对大分子吸附力大于小分子；对大分子吸附力大于小分子；n 对极性基团多的分子吸附力大于少的；对极性基团多的分子吸附力大于少的；n 易吸附气体易吸附气体“中毒中毒”，用前需活化，用前需活化，120加热加热4-5小时；小时；制备色谱技术第34页/共284页(5) 聚酰胺聚酰胺：又称为锦纶或尼龙又称为锦纶或尼龙n 同时具有良好的亲水性和亲脂性；同时具有良好的亲水性和亲脂性；n 可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；可溶于浓盐酸、甲酸，不溶于常见溶剂；n 含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类、醌含有丰富的酰胺基，与酚类、黄酮类

16、、醌类、脂肪酸类物质形成氢键；类、脂肪酸类物质形成氢键；n 还含有非极性脂肪链，双重保留机理；还含有非极性脂肪链，双重保留机理；制备色谱技术第35页/共284页(6) 大孔吸附树脂大孔吸附树脂：苯乙烯和丙烯酸酯苯乙烯和丙烯酸酯n骨架结构决定树脂的极性：骨架结构决定树脂的极性： 非极性、弱极性非极性、弱极性-苯乙烯或二乙烯基苯聚苯乙烯或二乙烯基苯聚合而成；合而成； 中等极性中等极性-甲基丙烯酸酯；甲基丙烯酸酯； 极性、强极性极性、强极性-含氧硫基、酰胺基、氮氧含氧硫基、酰胺基、氮氧等基团；等基团；n吸附和分子筛分离相结合吸附和分子筛分离相结合：网状结构，大：网状结构，大比表面积比表面积制备色谱技

17、术第36页/共284页大孔吸附树脂使用：大孔吸附树脂使用：n用前需预处理除去杂质：用前需预处理除去杂质： 回流法回流法、水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法； 渗漉法渗漉法-乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡乙醇丙酮等有机溶剂湿法装柱，浸泡12 h后洗脱后洗脱2-3倍柱体积，再浸泡倍柱体积，再浸泡3-5 h后洗脱后洗脱2-3倍柱体积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，倍柱体积，重复直到流出的有机溶剂与水混合不呈现白色乳浊现象为止，用大量蒸馏水洗去乙醇即可。如单独采用有机溶剂洗不尽杂质，则可用酸碱处理，2-5%盐酸、盐

18、酸、2-5%NaOH溶液浸泡，洗脱，水洗。溶液浸泡，洗脱，水洗。制备色谱技术第37页/共284页(7) 凝胶：凝胶：n交联葡聚糖交联葡聚糖Sephadex-葡聚糖和葡聚糖和3氯氯-1，2环氧丙烷以醚健交联形成的三维空间多孔凝胶环氧丙烷以醚健交联形成的三维空间多孔凝胶 交联度大，孔小，吸水膨胀小交联度大，孔小，吸水膨胀小 型号以其吸水量的型号以其吸水量的10倍命名倍命名，如，如Sephadex G-25表示每克干胶吸水表示每克干胶吸水2.5 g； 引入羟丙基，为引入羟丙基，为LH型烷基化葡聚糖凝胶型烷基化葡聚糖凝胶，不仅可分离水溶性成分，还可分离亲脂性成分，常用于最后的纯化，除去微量固体、盐类和

19、其他外来杂质，纯化过程中样品损失极小。，不仅可分离水溶性成分，还可分离亲脂性成分，常用于最后的纯化，除去微量固体、盐类和其他外来杂质，纯化过程中样品损失极小。制备色谱技术第38页/共284页n甲基丙烯酸酯共聚物甲基丙烯酸酯共聚物ToyopearlHW系列系列-乙二醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚乙二醇、甲基丙烯酸缩水甘油酯和二甲基丙烯酸季戊四醇酯共聚而成而成 稳定性好，稳定性好，pH2-12； 机械强度高，常用于加压柱色谱；机械强度高，常用于加压柱色谱； 在蛋白质、酶、核酸、多糖的纯化处理中应用较多；在蛋白质、酶、核酸、多糖的纯化处理中应用较多； ToyopearlHW40

20、可用于小分子物质的分离纯化，与可用于小分子物质的分离纯化，与SephadexLH20有相似的效果。有相似的效果。制备色谱技术第39页/共284页n琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶-D-半乳糖和半乳糖和3,6位脱水的位脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，半乳糖连接构成的多糖链，100时呈液态，时呈液态，45 下互相连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝胶。下互相连接成线性双链单环的琼脂糖，再凝聚成琼脂糖凝胶。 与与1,3-二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成二溴异丙醇在强碱条件下反应，生成CL型交联琼脂糖，稳定性更好，型交联琼脂糖，稳定性更好，pH3-14（一般的琼脂糖（一般的琼脂糖pH4.5-9.0 ）；

21、）；由于葡聚糖机械强度和筛孔的稳定性，流速较快。由于葡聚糖机械强度和筛孔的稳定性，流速较快。制备色谱技术第40页/共284页凝胶柱使用一般注意事项：凝胶柱使用一般注意事项：(1)交联度决定凝胶孔径大小，孔径决定排除交联度决定凝胶孔径大小，孔径决定排除下限；下限；(2)颗粒粗细很重要，细颗粒分离效果好，但颗粒粗细很重要，细颗粒分离效果好，但流速慢，宜采用大直径柱，粗颗粒流速快，流速慢，宜采用大直径柱，粗颗粒流速快，但分离效果差，宜采用小直径柱；但分离效果差，宜采用小直径柱；(3)干胶用量需考虑溶涨度干胶用量需考虑溶涨度制备色谱技术溶涨度干胶用量hr2第41页/共284页(4)干胶使用前需在干胶使

22、用前需在5-10倍的去离子水中充分倍的去离子水中充分溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮溶涨，倾倒掉小颗粒，减压排气。也可用煮沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。沸的方法溶涨，速度快，可灭菌排气。(5)填充均匀，无空隙和气泡；填充均匀，无空隙和气泡；(6)多次使用后，床体积减小或污染，可再生多次使用后，床体积减小或污染，可再生处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液处理，即用水逆向反复冲洗，再用缓冲溶液平衡。平衡。制备色谱技术第42页/共284页(8) 离子交换树脂离子交换树脂-阳离子交换和阴离子交换阳离子交换和阴离子交换 价态高，交换能力强；价态高，交换能力强； 价态相同，原子序数大能力强；价

23、态相同，原子序数大能力强； 两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下的离子状态；两性物质的交换取决于物化性质和特定条件下的离子状态；制备色谱技术第43页/共284页离子交换树脂的一般原则离子交换树脂的一般原则- 选择取决于被分离物质的电荷性质；选择取决于被分离物质的电荷性质； 强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活性不容易失去；强的使用范围宽，弱的分离生物大分子时，活性不容易失去； 反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的反离子；反离子，为了提高交换容量，选择结合力小的反离子； 亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水性的基质，活性易保持；亲疏水性选择，一般分离大分子时，选择疏水性的基质，活

24、性易保持；制备色谱技术第44页/共284页常规柱色谱的操作常规柱色谱的操作(1)装柱装柱：干法和湿法；：干法和湿法；(2)上样上样：液体上样和拌样上样，样品带尽可：液体上样和拌样上样，样品带尽可能窄；能窄；(3)洗脱洗脱：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面：始终保持洗脱剂液面高于柱床表面，可梯度洗脱；，可梯度洗脱；(4)流分收集流分收集：常采用固定体积收集法，结合：常采用固定体积收集法，结合TLC检验；检验；(5)样品回收样品回收：减压蒸馏或重结晶：减压蒸馏或重结晶制备色谱技术第45页/共284页干柱柱色谱干柱柱色谱 干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸干吸附剂，待分离样品配成浓溶液或吸附于少量填料

25、上上样，洗脱液接近色谱柱底附于少量填料上上样，洗脱液接近色谱柱底部时停止洗脱，挖出或切开色带。部时停止洗脱，挖出或切开色带。制备色谱技术时间短时间短节省试剂节省试剂玻璃柱玻璃柱尼龙柱尼龙柱第46页/共284页减压柱色谱 减压促进溶剂流动。制备色谱技术第47页/共284页n 与加压相比，变换溶剂更加方便；与加压相比，变换溶剂更加方便；n 吸附剂高度一般不超过吸附剂高度一般不超过5 cm；n 分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶分离过程中，逐渐增加洗脱剂中高极性溶剂 的 比 例 ， 开 始 阶 段 增 加 幅 度 较 小剂 的 比 例 ， 开 始 阶 段 增 加 幅 度 较 小(1%,2%,3%)

26、 ， 随 后 幅 度 逐 步 增 大， 随 后 幅 度 逐 步 增 大(5%,10%,20%等等)，通常收集，通常收集20-25个流分个流分即可将所有成分洗脱。即可将所有成分洗脱。制备色谱技术第48页/共284页(1)快速色谱法：约快速色谱法：约0.2 MPa；(2)低压液相色谱法：低压液相色谱法： 2 MPa；制备色谱技术第49页/共284页加压液相色谱制备分离方法的建立：加压液相色谱制备分离方法的建立：(1)采用薄层色谱确定分离条件。采用薄层色谱确定分离条件。 对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选对于快速和低压色谱，常用薄层色谱选择分离条件。择分离条件。 硅胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅

27、胶薄层色谱确定正相色谱条件，反相硅胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择硅胶薄层色谱确定反相色谱条件，一般选择Rf不大于不大于0.3且具有较好分离效果的展开剂。且具有较好分离效果的展开剂。制备色谱技术第50页/共284页(2)采用分析采用分析HPLC来确定分离条件。来确定分离条件。 对于中压和高压色谱则需要用分析对于中压和高压色谱则需要用分析HPLC条件进行选择。条件进行选择。 优化条件时，寻求较小的容量因子优化条件时，寻求较小的容量因子(k 99%；(2)纯品几乎完全回收，回收率纯品几乎完全回收，回收率 95%；(3)分离程序简单，不需要为了得到纯品进一分离程序简单，不需要为了得到纯品进一步分

28、析所得到的组分。步分析所得到的组分。制备色谱技术过载：低浓度时，进样量增加使得过载：低浓度时，进样量增加使得容量因子改变超过容量因子改变超过10第52页/共284页浓度过载和体积过载 制备色谱技术K不变，线性不变，线性结果可预测结果可预测K变化，非线性变化，非线性结果难预测结果难预测第53页/共284页边缘切割与循环色谱分离 分离不佳时 制备色谱技术密闭进样器是将流经检测器的柱流出液通过多通阀连至泵的入口；密闭进样器是将流经检测器的柱流出液通过多通阀连至泵的入口；交替柱循环装置是连接两根色谱柱，通过阀门将第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根色谱柱上循环分离。交替柱循环装置是连接两根色谱柱，通

29、过阀门将第二根色谱柱切割得到的样品再加到第一根色谱柱上循环分离。第54页/共284页中心切割制备色谱技术 适当损失组分，但避免色谱峰两端微量组分的污染。适当损失组分，但避免色谱峰两端微量组分的污染。第55页/共284页制备加压色谱设备要求制备加压色谱设备要求(1)泵：流量大，压力不需要太大；泵：流量大，压力不需要太大；(2)进样器：大样品环六通阀，环管细而长而进样器：大样品环六通阀，环管细而长而不是短而粗，样品溶液低浓度，大体积；不是短而粗，样品溶液低浓度，大体积；(3)色谱柱：装填均匀常采用柱床压缩技术即色谱柱：装填均匀常采用柱床压缩技术即径向压缩和轴向压缩；径向压缩和轴向压缩；(4)检测器

30、：不需要高灵敏；检测器：不需要高灵敏；制备色谱技术第56页/共284页快速色谱法 简单易行制备色谱技术第57页/共284页低压和中压色谱法 第七章 制备色谱技术第58页/共284页制备HPLC 制备色谱技术参数参数内径内径/mm长度长度/cm填料粒填料粒径径/ m柱效柱效进样量进样量/mg分析型柱分析型柱4-5253.5, 5500002525-5010更低更低更大更大第59页/共284页生产级的生产级的HPLC (1)溶剂花费是最大成本，昂贵、毒性、难处溶剂花费是最大成本，昂贵、毒性、难处理溶剂不使用；理溶剂不使用；(2)填料易得，性能好，重现性好；填料易得，性能好，重现性好；(3)溶剂回收

31、再用；溶剂回收再用；(4)直径大于直径大于5 cm的色谱柱需专门设计，保证的色谱柱需专门设计，保证床层稳定，避免高压破坏。床层稳定，避免高压破坏。制备色谱技术第60页/共284页第61页/共284页逆流色谱逆流色谱(CCC) 建立在逆流萃取分离的基础之上新型色建立在逆流萃取分离的基础之上新型色谱分离技术。谱分离技术。 逆流色谱可以广义地定义为：逆流色谱可以广义地定义为：(1)任何利任何利用两相不相混溶液的色谱技术；用两相不相混溶液的色谱技术；(2)其中一相其中一相以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管以一种相对均匀的方式纵向分布在一根空管或一系列的腔体中；或一系列的腔体中；(3)同时另一相以一

32、定的同时另一相以一定的速度通过第一相并与之混合。速度通过第一相并与之混合。第62页/共284页逆流色谱的发展历史：逆流色谱的发展历史：（1 1） 逆流分溶法逆流分溶法 2020世纪世纪5050年代，年代，CraigCraig发明的非连续逆流分溶发明的非连续逆流分溶装置，由一系列的分液漏斗连接而成。装置，由一系列的分液漏斗连接而成。缺点：设备复杂，易碎，溶剂体系容易乳化缺点：设备复杂，易碎，溶剂体系容易乳化，溶剂消耗量大，分离时间长，很快在，溶剂消耗量大，分离时间长，很快在6060年年代被液相色谱所取代。代被液相色谱所取代。第63页/共284页（2） 液滴逆流色谱液滴逆流色谱 1972年由年由T

33、okyo Rikakikai实现商品化，实现商品化，并广泛用于天然产物的分离。并广泛用于天然产物的分离。 缺点缺点：分离时间长，：分离时间长，23天，能够使用天，能够使用的溶剂体系有限，清洗困难，连接处容易的溶剂体系有限，清洗困难，连接处容易渗漏，渗漏，70年代后期逐渐被淘汰。年代后期逐渐被淘汰。 典型的装置由典型的装置由300根长度根长度60 cm内内径径1.8 mm的玻璃管组成，管柱之的玻璃管组成，管柱之间用窄内径的聚四氟乙烯管连接间用窄内径的聚四氟乙烯管连接。第64页/共284页是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使是在逆流分溶法基础上创建的色谱装置，可使流动相呈液滴流动相呈液滴形形式

34、在固定相间交换，促使溶质中各组分在两相之间进行分配，式在固定相间交换，促使溶质中各组分在两相之间进行分配，达到分离效果。达到分离效果。第65页/共284页缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程缺点：流动相流速低，每小时只有十几毫升；分离过程长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离长，一般需要几十小时才能完成一次几个组分的分离第66页/共284页的转速和倾角绕转盘中心轴转动。的转速和倾角绕转盘中心轴转动。第67页/共284页第68页/共284页第69页/共284页建立建立HSESHSES基础上的称为离心分配色谱。它是基础上的称为离心分配色谱。它是从从DCCCDCCC发展来的。发展

35、来的。离心力将固定相保留在一系列腔体中。噪声低，绝大部分的两相体系都可以使用。离心力将固定相保留在一系列腔体中。噪声低，绝大部分的两相体系都可以使用。死体积大，不能充分混合，分离效率和相同体积的流体动力学逆流色谱仪差。采用旋转密封接头，易产生渗漏。死体积大，不能充分混合，分离效率和相同体积的流体动力学逆流色谱仪差。采用旋转密封接头，易产生渗漏。SankiSanki逆流色谱仪逆流色谱仪第70页/共284页建立在建立在HDES基础上的逆流色谱仪是日本基础上的逆流色谱仪是日本Yoichiro Ito教授于教授于20世纪世纪70年代发明设计的多层螺旋管式离心分离仪。年代发明设计的多层螺旋管式离心分离仪

36、。螺旋管的行星式运动产生变化的离心力场将固定相保留在螺旋管中，并允许流动相快速通过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，分离效率较离心分配色谱螺旋管的行星式运动产生变化的离心力场将固定相保留在螺旋管中，并允许流动相快速通过螺旋管并与固定相进行连续高效的混合和分配，分离效率较离心分配色谱(Centrifugal Partition Chromatography, CPC)大大提高。大大提高。第71页/共284页（5）高速逆流色谱和双向逆流色谱）高速逆流色谱和双向逆流色谱 Ito教授在行星运动模式和螺旋管柱在支持体上的几何位置找到一种理想的结合状态，发展出一种特殊的同步行星运动模式（教授在行星

37、运动模式和螺旋管柱在支持体上的几何位置找到一种理想的结合状态，发展出一种特殊的同步行星运动模式（J模式），可在短时间内实现高效分离，并可实现两相流体在管内的双向流动。模式），可在短时间内实现高效分离，并可实现两相流体在管内的双向流动。第72页/共284页高速逆流色谱技术是一高速逆流色谱技术是一种不用任何同态载体的种不用任何同态载体的液液-液色谱技术，其原理液色谱技术，其原理是基于组分在旋转螺旋是基于组分在旋转螺旋管内的相对移动而互不管内的相对移动而互不混溶的两相溶剂间分布混溶的两相溶剂间分布不同而获得分离，其分不同而获得分离，其分离效率和速度可以与离效率和速度可以与HPLC相媲美。相媲美。第7

38、3页/共284页混合区：在靠近离心混合区：在靠近离心轴心大约有四分之一轴心大约有四分之一的区域，两相的激烈的区域，两相的激烈混合混合静置区：两相溶剂分静置区：两相溶剂分成两层，重相在外部成两层，重相在外部，轻相在内部，轻相在内部以以1000转转/ /分的速率进行旋分的速率进行旋转，在二维力场的作用下分转，在二维力场的作用下分离管柱内混合和传递的频率离管柱内混合和传递的频率可达到可达到1717次次/S/S，从而实现高，从而实现高效的分离效的分离第74页/共284页CsCmK Cs/Cm 第75页/共284页HSCCC的工作流程的工作流程PUMP:恒流泵恒流泵HSCCC centrifuge: 离

39、心机离心机Detecter:检测器检测器第76页/共284页（1） 溶剂的选择：最有效的溶剂组合应是样品在其中的分配系数溶剂的选择：最有效的溶剂组合应是样品在其中的分配系数0.2-5，最好接近，最好接近1，同时，是两相的分层时间尽可能短。，同时，是两相的分层时间尽可能短。 选择溶剂种类和配比的方法：选择溶剂种类和配比的方法：a.参比已有的溶剂系统参比已有的溶剂系统 b.高效液相色谱法高效液相色谱法 c.薄层色谱法薄层色谱法 d. 生物活性分配比法生物活性分配比法（2） 样品溶液的制备：样品溶液制备主要考虑样品的溶剂，样品量以及样品体积的大小。样品溶液的制备：样品溶液制备主要考虑样品的溶剂，样品

40、量以及样品体积的大小。（3） 分离：两相溶剂系统不需要脱气，但使用前必须互相饱和。分离：两相溶剂系统不需要脱气，但使用前必须互相饱和。（4） 检测：目前较为常用的是紫外检测器。重要的是保证基线的稳定。检测：目前较为常用的是紫外检测器。重要的是保证基线的稳定。第77页/共284页（6）pH区带精制逆流色谱区带精制逆流色谱1993-1994年间偶然的发现，即当在酸性物质的样品中加入一定浓度的有机酸时，可以产生一个非同寻常的窄而尖的峰，收集到的样品仅有几毫升。当样品量增大时，每个组分在柱中形成一个高浓度浓缩的等值年间偶然的发现，即当在酸性物质的样品中加入一定浓度的有机酸时，可以产生一个非同寻常的窄而

41、尖的峰，收集到的样品仅有几毫升。当样品量增大时，每个组分在柱中形成一个高浓度浓缩的等值pH区带，并以一个矩形峰被洗脱出来。在氨基酸、多肽、染料、生物碱等物质的分离中有很好的应用。区带，并以一个矩形峰被洗脱出来。在氨基酸、多肽、染料、生物碱等物质的分离中有很好的应用。（7）pH-区带区带-提取逆流色谱法：用于有机酸或碱的分离。通过在固定相中加入酸（或碱），将样品各组分保留在柱管内，而流动相中加入碱（或酸）来根据各组分的提取逆流色谱法：用于有机酸或碱的分离。通过在固定相中加入酸（或碱），将样品各组分保留在柱管内，而流动相中加入碱（或酸）来根据各组分的pKa和疏水性把这些组分逐一洗脱出来。和疏水性把

42、这些组分逐一洗脱出来。第78页/共284页 （8 8）离心沉淀色谱）离心沉淀色谱 逆流色谱技术逆流色谱技术. .利用两相溶剂在一根开管柱利用两相溶剂在一根开管柱中的逆向流动进行分离，由此中的逆向流动进行分离，由此ItoIto在在19981998年年联想到是否可以在开管柱的中间加一层半联想到是否可以在开管柱的中间加一层半透膜来实现蛋白质的连续沉淀分离。透膜来实现蛋白质的连续沉淀分离。 这种方法为生物大分子以及细胞等生物物这种方法为生物大分子以及细胞等生物物质的分离开辟了一个新的途径。质的分离开辟了一个新的途径。第79页/共284页2 2、逆流色谱的应用和发展趋势、逆流色谱的应用和发展趋势 以制备

43、为主，既适合小分子，也适合以制备为主，既适合小分子，也适合大分子。大分子。 目前的发展趋势目前的发展趋势：（：（1）研制更加适合）研制更加适合生物大分子分离制备的高速逆流色谱仪；生物大分子分离制备的高速逆流色谱仪；（2）目前该项技术还没有达到大规模工业）目前该项技术还没有达到大规模工业化生产的程度，在其放大过程中的一些技化生产的程度，在其放大过程中的一些技术问题需要进一步的研究解决。术问题需要进一步的研究解决。第80页/共284页3 3、逆流色谱的基本原理、逆流色谱的基本原理（1 1）流体静力学平衡体系（）流体静力学平衡体系（HSESHSES）第81页/共284页（2 2）流体动力学平衡体系（

44、）流体动力学平衡体系（HDESHDES）螺旋管的行星式运动产生一个强度和方向都变化的离心力场。在离心力高的时候，两相出现倾析，离心力发生逆转时，分开的两相又混合乳化，倾析和混合区域交替地出现在管中。螺旋管的行星式运动产生一个强度和方向都变化的离心力场。在离心力高的时候，两相出现倾析，离心力发生逆转时，分开的两相又混合乳化，倾析和混合区域交替地出现在管中。第82页/共284页重力场中旋转螺旋管内流体动力分布重力场中旋转螺旋管内流体动力分布 2000多年前，希腊数学家阿基米德利用旋转的螺旋结构将河水提升到河岸，他的这种装置叫做多年前，希腊数学家阿基米德利用旋转的螺旋结构将河水提升到河岸，他的这种装

45、置叫做“阿基米德螺旋阿基米德螺旋”。（。（a）重力作用使气泡处在上端、玻璃珠在下端，随着螺旋管的慢速转动，气泡和玻璃珠都向一个方向运动到螺旋管的一端，这一端通常称为首端，另一端称为末端。）重力作用使气泡处在上端、玻璃珠在下端，随着螺旋管的慢速转动，气泡和玻璃珠都向一个方向运动到螺旋管的一端，这一端通常称为首端，另一端称为末端。第83页/共284页（b）上图是小体积重相的情况，下图是小体积轻相的情况第84页/共284页（c c）重相和轻相差不多的情况，螺旋管的旋转使得两相竞争地向首端迁移，不久，两相在首端建立了一种流体动力学平衡，在每一圈管内两相占据几乎相同的体积。任何一相的过量都会被推向螺旋管

46、的尾端一侧。一旦这种平衡建立起来，螺旋管的继续转动，只会使两相在每一圈管内前后混合，两相在螺旋管内的总体分布不变。）重相和轻相差不多的情况，螺旋管的旋转使得两相竞争地向首端迁移，不久，两相在首端建立了一种流体动力学平衡，在每一圈管内两相占据几乎相同的体积。任何一相的过量都会被推向螺旋管的尾端一侧。一旦这种平衡建立起来，螺旋管的继续转动，只会使两相在每一圈管内前后混合，两相在螺旋管内的总体分布不变。第85页/共284页进一步的研究表明，流体动力学平衡体系中进一步的研究表明，流体动力学平衡体系中两相的体积比与螺旋管的转速两相的体积比与螺旋管的转速密切相关。密切相关。第一区段：慢速区，两相均衡分布；

47、第一区段：慢速区，两相均衡分布；第二区段：临界转速范围，两相建立起单向性流体动力学平衡，重相完全占据首端一侧；第二区段：临界转速范围，两相建立起单向性流体动力学平衡，重相完全占据首端一侧；第三区段：临界转速后，重相在首端一侧量迅速减小，进一步提高转速又回复两相均衡分布的状态。第三区段：临界转速后，重相在首端一侧量迅速减小，进一步提高转速又回复两相均衡分布的状态。氯仿乙酸水体系氯仿乙酸水体系第86页/共284页螺旋管内的两相溶螺旋管内的两相溶剂分配是一个复杂剂分配是一个复杂的流体动力学现象的流体动力学现象，现在还难以准确，现在还难以准确用数学公式解释。用数学公式解释。该分配作用与螺旋该分配作用与

48、螺旋管不同部位的离心管不同部位的离心力有关。力有关。第87页/共284页1 1）当转速慢时，离心力可以忽略，重力起主）当转速慢时，离心力可以忽略，重力起主要作用，此时，阿基米德螺旋力同时对两相要作用，此时，阿基米德螺旋力同时对两相起作用，竞争性地建立平衡。起作用，竞争性地建立平衡。2 2）临界范围转速时，由于径向离心力场的加）临界范围转速时，由于径向离心力场的加强，使得作用在螺旋管底部的净力场增强，强，使得作用在螺旋管底部的净力场增强，顶部的净力场减弱，在这种不对称力场的作顶部的净力场减弱，在这种不对称力场的作用下，重相向首端的迁移被加速，轻相的迁用下，重相向首端的迁移被加速，轻相的迁移受到阻

49、碍，结果在螺旋管内产生一种单向移受到阻碍，结果在螺旋管内产生一种单向性的流体动力学分配。性的流体动力学分配。第88页/共284页3 3）转速进一步增加时，产生一个更强的径向）转速进一步增加时，产生一个更强的径向离心力场，使两相溶剂重新分配，重相占据离心力场，使两相溶剂重新分配，重相占据螺旋管的外层空间，轻相占据螺旋管的内层螺旋管的外层空间，轻相占据螺旋管的内层空间，最终导致在整个螺旋管内每一圈均等空间，最终导致在整个螺旋管内每一圈均等分布（开始时注入等体积的两相）。分布（开始时注入等体积的两相）。第89页/共284页J J型行星式运动螺旋管内，转速型行星式运动螺旋管内，转速750r/min75

50、0r/min，靠近中心轴的约，靠近中心轴的约1/41/4区域两相剧烈混合，其余区域两相分层，重相占据外部，轻相占据管内部，沿螺旋管形成一个清晰的界面。每个混合区都向螺旋管的首端行进，行进速率与管柱的公转速率相同。流动相恒速通过固定相时，在管柱内任何部位的两相都以极高的速率进行混合和沉积分配过程，频率可达区域两相剧烈混合，其余区域两相分层，重相占据外部，轻相占据管内部，沿螺旋管形成一个清晰的界面。每个混合区都向螺旋管的首端行进，行进速率与管柱的公转速率相同。流动相恒速通过固定相时，在管柱内任何部位的两相都以极高的速率进行混合和沉积分配过程，频率可达1313次次/s/s。混合区沉积区第90页/共2

51、84页当螺旋管以超过临界速度旋转时，两相溶剂在当螺旋管以超过临界速度旋转时，两相溶剂在柱子里面建立一种单向性的流体动力学平衡，柱子里面建立一种单向性的流体动力学平衡，这样分别将尾端相从首端引入，首端相从尾端这样分别将尾端相从首端引入，首端相从尾端引入，则可以实现双向逆流色谱分离。引入，则可以实现双向逆流色谱分离。第91页/共284页4 4、影响逆流色谱的两相分布的物理参数、影响逆流色谱的两相分布的物理参数1 1）疏水性，对于上相为有机溶剂，下相为）疏水性，对于上相为有机溶剂，下相为水相的体系，增强疏水性有利于上相移向首水相的体系，增强疏水性有利于上相移向首端，下相移向尾端；端，下相移向尾端；2

52、 2）增大两相界面张力；）增大两相界面张力；3 3）减小溶剂的粘度；）减小溶剂的粘度；4 4）增大两相的密度差；）增大两相的密度差；5 5）加大）加大 值（自传半径值（自传半径/ /公转半径），可以公转半径），可以减小公转半径，或者加大螺旋管半径。减小公转半径，或者加大螺旋管半径。第92页/共284页（4）pH区带精制逆流色谱（区带精制逆流色谱（pH zone refining CCC） I t o 在 研 究 高 速 逆 流 色 谱 分 离 纯 化在 研 究 高 速 逆 流 色 谱 分 离 纯 化BrAcT3(N-溴乙酰基溴乙酰基-3,3,5-三碘代甲腺氨酸三碘代甲腺氨酸）时，观察到产物形成

53、了一个非同寻常的尖）时，观察到产物形成了一个非同寻常的尖峰，其理论塔板数高于峰，其理论塔板数高于2000，而相邻的杂质，而相邻的杂质峰显示正常峰宽，理论塔板数峰显示正常峰宽，理论塔板数500左右。左右。第93页/共284页采用由正己烷采用由正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-15 mmol/L醋酸醋酸胺缓冲溶液组成的胺缓冲溶液组成的pH值为值为4的两相溶剂体系。的两相溶剂体系。第94页/共284页对收集组分进行对收集组分进行pHpH值测量时发现，值测量时发现，pHpH曲线在溶剂峰后曾出现一段逐渐下降的趋势，然后恰巧在产物尖峰出现的位置急剧增加。样品溶液的质谱分析显示溴乙酸的出现，这是合成反应的

54、副产物。曲线在溶剂峰后曾出现一段逐渐下降的趋势，然后恰巧在产物尖峰出现的位置急剧增加。样品溶液的质谱分析显示溴乙酸的出现，这是合成反应的副产物。 第95页/共284页现在将溴乙酸称为现在将溴乙酸称为“保留酸保留酸”，因为它能将，因为它能将分析物在柱中保留更长的时间。近年来的研分析物在柱中保留更长的时间。近年来的研究表明，很多有机酸都可以单独或者混合作究表明，很多有机酸都可以单独或者混合作为保留酸。为保留酸。进一步的研究表明，将保留酸加入固定相中进一步的研究表明，将保留酸加入固定相中会产生在样品溶液中类似的效果。会产生在样品溶液中类似的效果。第96页/共284页由于其非线性等温线，保留酸形成了一

55、个陡峭的缓行边界，该边界在柱中移动的速度比流动相慢。由于其非线性等温线，保留酸形成了一个陡峭的缓行边界，该边界在柱中移动的速度比流动相慢。 当酸性分析物出现在位置当酸性分析物出现在位置(1)(1)时，由于低的时，由于低的pHpH值形成疏水的中值形成疏水的中性形式，并且随后进入有机固定相的位置性形式，并且随后进入有机固定相的位置(2)(2)。随着陡峭保留。随着陡峭保留边界迁移，分离物暴露与一个较高边界迁移，分离物暴露与一个较高pHpH位置位置(3)(3)，此时失去质子，此时失去质子并且转移到水相并且转移到水相(4)(4)，在水相中分析物快速传过陡峭边界重复，在水相中分析物快速传过陡峭边界重复上述

56、循环。因此，分析物总是被限定在保留酸的边界中伴随着上述循环。因此，分析物总是被限定在保留酸的边界中伴随着保留酸边界洗脱成一个尖峰。保留酸边界洗脱成一个尖峰。第97页/共284页为了将分析物限制在保留边界附近，必须满足一定的条件。第98页/共284页该方法允许使用多重的保留酸为间隔剂（该方法允许使用多重的保留酸为间隔剂（spacer），使不同的被分离物以窄峰的形式），使不同的被分离物以窄峰的形式出现在保留酸的边界上。出现在保留酸的边界上。第99页/共284页进样量由进样量由1 mg增加到增加到100 mg，其余条件与前，其余条件与前图相同，可以发现有没有保留酸和间隔酸效图相同，可以发现有没有保留

57、酸和间隔酸效果相差十分明显。果相差十分明显。第100页/共284页与与HPLCHPLC的比较：的比较：简单，相比不一样，达到简单，相比不一样，达到同样的分离度需要的理论塔板数少。同样的分离度需要的理论塔板数少。第101页/共284页逆流色谱的应用：逆流色谱的应用： 制备，特别是中药成分的提取（目前最制备，特别是中药成分的提取（目前最主要的应用领域）。主要的应用领域）。第102页/共284页第103页/共284页第104页/共284页长春花生物碱的长春花生物碱的 HSCCC - UV HSCCC - UV 色谱图色谱图第105页/共284页第106页/共284页第107页/共284页第108页/

58、共284页p/PaT/ C。三相点固态液态气态临界点超临界流体第109页/共284页第110页/共284页第111页/共284页注射泵样品进样阀色谱柱限流器出口检测器压力/密度控制温度控制微处理机键盘屏幕电位计数据超临界流体色谱仪流程图炉第112页/共284页第113页/共284页第114页/共284页第115页/共284页分 子 直 径 /um相 对 分 子 质 量 /1.66x10-27kg11031061090.00010.0010.010.1GCLCSFCSEC各 种 色 谱 法 测 定 相 对 分 子 量 范 围 比 较第116页/共284页 通常的色谱存在下列问题：通常的色谱存在下

59、列问题：(1)(1)不能连续操作；不能连续操作；(2)(2)溶剂和分离材料利用率低；溶剂和分离材料利用率低；(3)(3)流出组分被高度稀释；流出组分被高度稀释； SMBSMB同样的分离材料，生产力增加同样的分离材料，生产力增加6060倍，溶倍，溶剂消耗量减少剂消耗量减少8080倍。倍。制备色谱技术第117页/共284页模拟移动床色谱原理：模拟移动床色谱原理： 制备色谱技术第118页/共284页第119页/共284页各个分区分别完成不同的功能分区各个分区分别完成不同的功能分区IVIV主要用来吸附多余的没有采出的组分主要用来吸附多余的没有采出的组分A A；分区皿主要吸附组分；分区皿主要吸附组分B

60、B；分区；分区1111用来洗脱组分用来洗脱组分A A；分区；分区I I主要用来洗脱没有采出的组分主要用来洗脱没有采出的组分B B 移动床色谱虽然有可连续操作和分离效果好的特点，但是在实际操作中实现固定相的流动非常困难，而引人模拟移动床思想就能够很好地解决固定相实际流动困难的问题它可以在固定相不动的情况下，通过一定的切换序列，模拟出固定相和溶剂间相对流动的效果。移动床色谱虽然有可连续操作和分离效果好的特点，但是在实际操作中实现固定相的流动非常困难，而引人模拟移动床思想就能够很好地解决固定相实际流动困难的问题它可以在固定相不动的情况下，通过一定的切换序列，模拟出固定相和溶剂间相对流动的效果。第12