高效液相色谱法测定水样中的苯酚

1、实验三高效液相色谱法测定水样中的苯酚一、实验目的1.1熟悉HPLC仪器的各个部件及熟悉操作方法；1.2掌握应用高效液相色谱法对苯酚的定性、定量分析;1.3掌握水样中苯酚的测定。二、实验原理HPLC® 理高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上， 流动相改为高压输送（最高输送压力可达 4.9'107Pa）;色谱柱是以特殊的方法 用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高丁经典液相色谱（每米塔板数可达 几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 特点1 .高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻 力较

2、大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。一般可达 150 350 xi05Pa。2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达110ml/min。高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少丁1h。3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。4. 高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的 灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达 10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。5. 适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点 太高的物质或热

3、稳定性差的物质都难丁应用气相色谱法进行分析。而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。对 丁高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大丁 400以上）的有机物（这些物质 几乎占有机物总数的75%80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分 离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%,而能用液相色谱分析的约占7080%。高效液相色谱仪一般分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和 检测系统。此外还可以根据一些特殊的要求配备一些附届装置， 如梯度洗脱、自 动进样及数据处理装置等，如图1所示。井气道图1液相色谱仪结构示意图及工作流程图方法原

4、理：在相同的色谱条件下，相同物质具有相同的保留时间，据此可 对某物质进行定性分析；在一定浓度范围内，待测物质含量与仪器响应值呈线性 关系，通过建立标准曲线，可实现对待测物质的定量分析。三、仪器和试剂1、仪器：岛津（SHIMADZU ） LC-20A液相色谱仪： 流动相：乙睛、 MQ水（由铝箔纸包裹，防止其中产生藻类，堵塞进口） 高压输液泵：并联式微体积柱塞往复泵（Prominence LIQUID CHROMATOGRAPH ）型号：LC-20AD厂家：UFLC SHIMADZU 色谱柱：固定相填充物：十八碳（C18 ）型号：Intertsil ODS-SP参数：填充物粒径：5 m 内径X长度

5、：4.6 X250 mm 检测器：二极管阵列检测器（PDA）型号：SPD-M20A 电压：230V厂家：SHIMADZU 脱气装置：型号：DQO-20A5 进样装置：高压六通进样阀两个状态：Load :样品进入六通阀，未入色谱柱Inject :位于六通阀的样品进入色谱柱种类：SIL-10A 、SIL-10Ai 、SIL-10ADVP淋洗液（洗针、洗阀）：甲醇移液管2 mL、5 mL各一支具塞离心管 10 mL 三支、1.5 mL 一次性离心管一支2.试剂：甲醇（色谱纯）；苯酚标准使用溶液（10 mg/L） 待测水样。四、实验步骤1标准系歹U配制取苯酚标准使用液0.50、1.00、2.00 mS

6、 10 mL的具塞离心管中，用甲醇定 容至5 mL,混匀。待测。2样品的制备取水样约1 mb 1.5 mL一次性离心管中。待测。3色谱参数色谱柱：C18柱；流动相：乙腊、水;梯度洗脱程序：洗脱时间0:004:004:015:005:018:00乙腊（%）656575756565流速：1.0 mL/min；柱温：室温；进样量：20 H %检测器：二极管阵列检测器，检测波长 280 nm4测定测定标准系歹0,再测定样品。根据标准系歹0中苯酚的保留时间， 定性确定样 品中的目标物。记录标准系列和样品中目标物的峰面积。五、数据记录与计算（1）标准系歹U c=4mg/mL 的谱图及样品的谱图：样品谱图（

7、图2）中，三个明显高的峰的记录数据如下表表1样品的谱图中三个峰的特征数据保留时间（t/min ）色谱峰面积/counts色谱峰高/mAU第一个峰3.892229072928第二个峰4.307182.47第三个峰4.879205676.0 '280nm,4nm (1.00)65.5 '735.0A11-4.5 ' i4.03.5 '_1_3.0 '2.5 '1_1l_2.0 '_L_1.5 '1.0 -0.5 _0.0 -1 rIL一一八J-0.5 -111 i1 J .-, ,”.-mAU0.00.51.01.52.02.53.0

8、3.54.04.5min图1 标准系列c=4mg/mL 的谱图图2样品的谱图2.标准系列和样品中苯酚的保留时间、峰面积、峰高等实验数据:表2标准系列和样品中苯酚的谱图峰的特征数据标准样品体积/mL保留时间t/min色谱峰面积/counts色谱峰高/mAU浓度/(mg/mL)10.53.9511764012091.021.03.8373475429632.032.03.7736662552584.0样品一3.8922290729281.3六、思考题1液相色谱使用的注意事项；答：流动相必须用HPL徵的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质 （使用0.45um或更细的膜过滤），气泡会致使压力

9、不稳，重现性差，所以在使用过 程中要尽量避免产生气泡。每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂活洗进样器， Cl"绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。如果进液管内不进液体时，要使 用注射器吸液：通常在输液前要进行流动相的活洗， 更换流动相时应该先将吸滤 头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中，更换无互溶性的流动 相时要用异丙醇过渡一下。2何谓梯度洗脱，有何特点；答：梯度洗脱是采用两种（或多种）不同洗脱能能力的溶剂，在分离过程中按一定 程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式.当样品混合物中化合物 的保留差异很大，用单一流动相等度洗脱时，分离时间太长，而且随保留值增大, 后洗脱的色谱峰谱带变宽，使峰检测发生困难.有时甚至会发生部分化合物保留 太强，不能洗脱下来，此时采用梯度洗脱.梯度洗脱一般用液相色脯装置来实现. 高压梯度，低压梯度两种装置.3正相高效液相色谱与反相有何差别。答：高效液相色谱法包括