微生物的纯培养和显微技术

1、微生物的纯培养和微生物的纯培养和显微技术显微技术微生物的基本特点：微生物的基本特点：小小t 在绝大多数情况下都是利用微生物的群体在绝大多数情况下都是利用微生物的群体 来研究其属性；来研究其属性；t 微生物的物种（菌株）一般也是以群体的微生物的物种（菌株）一般也是以群体的 形式进行繁衍、保存；形式进行繁衍、保存；培养技术在微生物学中具有重要意义！培养技术在微生物学中具有重要意义！在研究中所使用的微生物培养群体：在研究中所使用的微生物培养群体：培养物：培养物：在一定的条件下培养、繁殖得到的在一定的条件下培养、繁殖得到的 微生物群体。微生物群体。混合培养物混合培养物: :含有多种微生物的培养物；含有

2、多种微生物的培养物；纯培养物纯培养物: :只有一种微生物的培养物；只有一种微生物的培养物；通常情况下只有纯培养物才能提供可以通常情况下只有纯培养物才能提供可以重复的结果重复的结果纯培养技术是进行微生物学研究的基础！纯培养技术是进行微生物学研究的基础！ 微生物个体微小的特点也微生物个体微小的特点也决定了决定了显微技术是进行微生物研究的另一项显微技术是进行微生物研究的另一项重要技术，因为绝大多数微生物的个重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究。才能进行观察和研究。微生物的基本特点：微生物的基本特点：小第一节第一节 微生物的

3、分离和纯培养微生物的分离和纯培养 从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，从混杂的群体中分离特定的某一种微生物，是研究和利用微生物的第一步。是研究和利用微生物的第一步。一、无菌技术一、无菌技术t 用于分离、培养微生物的器具事先不含任用于分离、培养微生物的器具事先不含任 何微生物；何微生物；t 在转接、培养微生物时防止其它微生物的在转接、培养微生物时防止其它微生物的 污染；其污染；其自身也自身也 不污染环境不污染环境。1 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具： 试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等1887年，年，R J Petri 发明发明 Pe

4、tri dish高温干热灭菌高温干热灭菌高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌试管、瓶子、培养皿等试管、瓶子、培养皿等常用的灭菌方法：常用的灭菌方法：1 1、微生物培养的常用器具及其灭菌、微生物培养的常用器具及其灭菌常用的器具：常用的器具：2 2、接种操作、接种操作无菌操作：无菌操作： 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行2 2、接种操作、接种操作无菌操作：无菌操作：在无菌箱或操作室内无菌的环境在无菌箱或操作室内无菌的环境下进行下进行二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基：培养基：液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半固体培养基；二、用固

5、体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养培养基培养基液体培养基；液体培养基；固体培养基；固体培养基；半固体培养基；半固体培养基；琼脂琼脂二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养菌落菌落（colony）：）： 单个（或聚集在一起的一团）微生物在适单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、程度可以形成肉眼可见的、 有一定形态结构有一定形态结构的子细胞生长群体的子细胞生长群体. .众多菌落连成一片众多菌落连成一片菌苔菌苔（lawn）不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳

6、定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。（各种微生物形成的菌落特征各种微生物形成的菌落特征）同一细菌在不同的培养平板上形成同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落不同的特征菌落二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养使微生物在固体培养基平板上形成使微生物在固体培养基平板上形成单个菌落的基本方法：单个菌落的基本方法：稀释稀释二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养2 2、稀释倒平板法、稀释倒平板法1 1、涂布平板法、涂布平板法操作较麻烦操作较麻烦,对好对好氧菌、热敏感菌氧菌、热敏感菌效果不好效果不好使用较多的常使用较多的常规方法，但有规方

7、法，但有时涂布不均匀时涂布不均匀二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养3 3、平板划线法、平板划线法二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离厌氧罐厌氧罐厌氧手套箱厌氧手套箱二、用固体培养基分离纯培养二、用固体培养基分离纯培养4 4、厌氧微生物的分离、厌氧微生物的分离稀释摇管法稀释摇管法23三、用液体培养基分离纯培养三、用液体培养基分离纯培养0.0480.048 + 0.0012 + 0.0002= 0.975 稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中的许多平行试管中, ,大多数大

8、多数（一般应超过一般应超过95%）表现为不生长。表现为不生长。例如例如: :若同一稀释度的试管中有若同一稀释度的试管中有95%95%表现为不生长，表现为不生长，则生长的试管中仅则生长的试管中仅含一个细胞的几率为含一个细胞的几率为: : 4.8% 含二个细胞的几率为含二个细胞的几率为: : 0.12% 含三个细胞的几率为含三个细胞的几率为: : 0.002%在有细菌生长的在有细菌生长的试管试管中得到纯培养的几率为中得到纯培养的几率为97.5%1878年，年，Lister 分离乳酸链球菌时所使用的分离乳酸链球菌时所使用的微量注射器和酒杯培养装置微量注射器和酒杯培养装置注射器的最小注射器的最小吸取量

9、吸取量: :0.00062 毫升毫升四、单细胞（孢子）分离四、单细胞（孢子）分离t 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；一般采用显微操作仪，在显微镜下进行；t 操作难度与细胞或个体的大小成反比；操作难度与细胞或个体的大小成反比；五、选择培养分离五、选择培养分离t 抑制大多数其它微生物的生长；抑制大多数其它微生物的生长；t 使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量使待分离的微生物在群落中的数量上升上升,方便用稀释法对其进行纯化方便用稀释法对其进行纯化.微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化 没有一种培养基或一种培

10、养条件能够满足自然界中没有一种培养基或一种培养条件能够满足自然界中 一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基一切生物生长的要求，在一定程度上所有的培养基都是选择性的。都是选择性的。t 使待分离的微生物生长使待分离的微生物生长“突出突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养.五、选择培养分离五、选择培养分离1. 1. 利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制t 高温下培养高温下培养: :分离嗜热细菌分离嗜热细菌t 培养基中不含培养基中不含N:分离固氮菌分离固氮

11、菌t 培养基加抗生素培养基加抗生素:分离抗性菌分离抗性菌五、选择培养分离五、选择培养分离1. 1. 利用选择平板进行直接分离利用选择平板进行直接分离待分离的微生物的生长特征待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物明显不同于其它微生物 颜色反应颜色反应: :分离特定的菌株分离特定的菌株牛奶平板牛奶平板: :分离蛋白酶产生菌分离蛋白酶产生菌 利用特定细菌的滑动特点利用特定细菌的滑动特点 进行分离纯化进行分离纯化；五、选择培养分离五、选择培养分离2. 2. 富集培养富集培养从自然界中分离到所需的特定微生物从自然界中分离到所需的特定微生物特定的环境条件特定的环境条件仅适应于该条件的微生物旺盛生长仅

12、适应于该条件的微生物旺盛生长待分离微生物在群落中的数量大大增加待分离微生物在群落中的数量大大增加2. 2. 富集培养富集培养富集培养富集培养是微生物学家最强有力的技术手段之是微生物学家最强有力的技术手段之一一.营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式营养和生理条件的几乎无穷尽的组合形式可应用于从自然界选择出特定微生物的需要可应用于从自然界选择出特定微生物的需要.根据微生物的特殊要求根据微生物的特殊要求,从自然界分离出特定已知从自然界分离出特定已知微生物种类；微生物种类；分离培养在特定环境中能生长的微生物；分离培养在特定环境中能生长的微生物；六、二元培养物六、二元培养物 培养物中只含有二种微生物，而

13、且是有意培养物中只含有二种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。二元培养物。t 病毒和宿主细胞；病毒和宿主细胞；t 纤毛虫、变形虫和粘细菌；七、微生物的保藏技术七、微生物的保藏技术（见第九章（见第九章 微生物的遗传变异与育种）微生物的遗传变异与育种）微生物学实验室的常规操作程序微生物学实验室的常规操作程序第二节第二节 显微镜和显微技术显微镜和显微技术几个基本概念：几个基本概念：放大放大 分辨率分辨率 反差反差被观察物越小被观察物越小,放大倍数应越大放大倍数应越大,否则难否则难以看清以看清能辨别两点之间最小距离的能力能辨别两点之

14、间最小距离的能力被观察物区别于背景的程度被观察物区别于背景的程度与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行与显微镜的自身特点有关，但也取决于进行显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标显微观察时对显微镜的正确使用及良好的标本制作和观察技术，这就是本制作和观察技术，这就是显微技术显微技术。一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜简单显微镜简单显微镜复式显微镜复式显微镜一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？为什么？如何实现光学显

15、微镜一般配置最大放大倍数？如何实现光学显微镜一般配置最大放大倍数？其原理？其原理？目镜：目镜：10 15 物镜：物镜： 100 总放大倍数总放大倍数10001500 使用油镜使用油镜, ,即在即在100 物镜和载玻片之间物镜和载玻片之间滴加香柏油；滴加香柏油； 0.5 l l分辨率（最小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）= = n sin q q1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜分辨率与所用分辨率与所用波长波长(l)l)成反比成反比1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜 0.5 l l分辨率（最小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）= = n sin q qq q为物镜镜口角的半数为

16、物镜镜口角的半数,它取决于物镜的直径它取决于物镜的直径和工作距离和工作距离1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜 0.5 l l分辨率（最小可分辨距离）分辨率（最小可分辨距离）= = n sin q qn: :玻片与物镜间介质的折射率玻片与物镜间介质的折射率显微观察时可根据物镜的特性选用不同介质显微观察时可根据物镜的特性选用不同介质空气空气 ( (n=1.0) n=1.0) 水水 ( (n=1.33)n=1.33)、香柏油香柏油 ( (n=1.52) n=1.52) 玻璃玻璃 ( ( n=1.54)n=1.54)1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜光线在穿过折射率不同的介质时发生折射光线

17、在穿过折射率不同的介质时发生折射1. 1. 普通光学显微镜普通光学显微镜玻璃透镜的工作原理玻璃透镜的工作原理 很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的光线可以进入物镜射而损失的光线可以进入物镜,使照明亮度提使照明亮度提高高,改善观察效果。改善观察效果。用浸没油取代空气的作用：用浸没油取代空气的作用：介质折射率提高介质折射率提高数值孔径值和分辨率数值孔径值和分辨率均得到提高均得到提高浸没油与玻璃的折射率相近浸没油与玻璃的折射率相近物物镜镜特特性性搜索物镜低倍镜高倍镜油镜放放大大倍倍数数41040-4590-100数数值值孔孔径径值值0.100.250

18、.55-0.651.25-1.4焦焦距距（f）40 mm16 mm4 mm1.8-2.0 mm工工作作距距离离17-20 mm4-8 mm0.5-0.7 mm0.1 mm450nm光光源源（蓝蓝光光）时时的的分分辨辨率率2.3 m0.9 m0.35 m0.18 m光学显微镜物镜的特性人眼的分辨能力在人眼的分辨能力在0.2 mm左右左右,因此因此光学显微光学显微镜镜的最大的最大有效放大倍数有效放大倍数（使用油镜使用油镜）是是1,000到到1,500。普通光学显微镜即普通光学显微镜即: :明视野显微镜明视野显微镜其照明光线直接进其照明光线直接进入视野入视野, ,属透射照明属透射照明一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理2.2.明明视野显微镜视野显微镜一、显微镜的种类及原理一、显微镜的种类及原理3. 3. 相差显微镜相差显微镜形成亮背景暗物象的结果形成亮背景暗物象的