氨基酸源对热反应牛肉香精中氯丙醇形成的影响

1、氨基酸源对热反应牛肉香精中氯丙醇形成的影响黄明泉，夏艳秋，李 娟，邹青青，孙宝国，张玉玉（北京工商大学食品学院，北京市食品风味化学重点实验室，北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京 100048）摘 要：采用气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）仪对热反应牛肉香精及其原料中的氯丙醇进行了分析，并通过单因素试验考察了水解植物蛋白（hydrolyzed vegetable protein，HVP）液、酵母浸膏、VB1、牛肉酶解物、半胱氨酸、谷氨酸、牛骨素、甘氨酸和丙氨酸等原料对热反应牛肉香精中3-氯-

2、1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD）生成的影响。结果发现，4 种氯丙醇中3-MCPD是牛肉香精的主要污染物，且牛肉香精原料中都含有一定量的3-MCPD；牛肉香精原料中所检测的各种氨基酸源对3-MCPD的含量均有显著影响。关键词：热反应牛肉香精；氯丙醇；氨基酸源；气相色谱-质谱联用仪热反应肉味香精是一种食品添加剂，由还原糖类、多种氨基酸及其他原料在一定条件下加热反应生成的，在传统食品的现代化发展和餐饮行业的连锁化发展过程中肉味香精起到了很大的作用1。在生产加工热反应肉味香精的过程中糖类和氨基酸是必不可少的原料，六碳糖（包括葡萄糖、果糖、半乳糖等）和五碳

3、糖（包括核糖、木糖等）是常用的糖源，氨基酸源主要有水解蛋白（包括植物水解蛋白（hydrolyzed vegetable protein，HVP）和动物水解蛋白（hydrolyzed animal protein，HAP）、酵母、氨基酸等2。目前，肉味香精的制备技术已由单一的调配技术发展到了调配技术与酶解技术、脂肪调控氧化技术、美拉德反应技术相结合，制备原料由单一的氨基酸变为氨基酸、HVP液、HAP液和酵母等各种富含氨基酸的原料相搭配进行肉味香精的制备3。在食品生产过程中，由于生产工艺与原料的原因可能会带来亚硝基化合物、氯丙醇、苯并芘等4-9有害物质，热反应肉味香精则与食品相类似，故推测肉味香精

4、中可能含有氯丙醇。氯丙醇类物质早已在世界范围内被认为是在食品加工过程中形成的一种有害物质10。3-氯-1,2-丙二醇（3-chloro-1,2-propanediol，3-MCPD）是氯丙醇类化合物的毒性参照物，其最初存在于水解植物蛋白液、配制酱油中11，后来又在膨化食品、面包、熏肉、饼干等食品中发现12-16。据文献报道氯丙醇具有生殖毒性17、致突变性、致癌性及一定的神经毒性18等，故许多国家为了控制食品中氯丙醇的污染，制定了不同的限量标准，如我国规定酸水解植物蛋白调味液中的3-MCPD含量不得高于1.0 mg/kg，而欧盟规定的限量为不得高于0.02 mg/kg（以其中干基含量为40%计算

5、）16。目前，关于氯丙醇在食品中的研究比较多，但在热反应香精中的污染状况以及影响因素鲜见相关报道。本实验主要以热反应牛肉香精为例，来考察实际生产过程中热反应肉味香精所用原料各种氨基酸源（如牛肉酶解物、半胱氨酸等），对热反应肉味香精中3-MCPD形成的影响。研究可为热反应肉味香精的安全生产提供参考，对维护肉味香精行业的健康发展具有参考意义。1 材料与方法1.1 材料与试剂牛肉（背腰肉、后臀肉）购于北京市海淀区美廉美超市；牛骨素（清汤）、复合料（由生姜、八角、花椒、肉豆蔻等按一定的比例配制而成）、酵母浸膏 湖北安琪酵母股份有限公司；风味酶、胰酶 北京味食源食品科技有限责任公司。正己烷、无水乙醚、无

6、水硫酸钠、标准品3-MCPD、2-氯-1,3-丙二醇（2-chloro-1,3-propanediol，2-MCPD）、1,3-二氯-2-丙醇（1,3-dichloro-2-propanol，1,3-DCP）和2,3-二氯-1-丙醇（2,3-dichloro-1-propanol，2,3-DCP）（均为分析纯）、Celite545硅藻土（试剂级）、2,2,4-三甲基戊烷（纯度99.5%）、L-谷氨酸、L-半胱氨酸、L-丙氨酸、L-甘氨酸（食品级） 国药集团化学试剂有限公司；七氟丁酰基咪唑（纯度97%） 北京百灵威科技有限公司。1.2 仪器与设备气密针（1.0 mL） 美国Agilent公司；厚

7、壁耐压管（15mL，15#）、玻璃层析柱（有效柱长305mm；内径26mm） 北京欣维尔玻璃仪器有限公司；T-403型电子天平（感量0.001 g） 北京赛多利斯仪器系统有限公司；电动搅拌器 北京浩海科仪科技有限公司；BF-2000氮气吹干仪 北京八方世纪科技有限公司；TRACE ULTRA-DSQ气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）仪美国Thermo Fisher公司。1.3 方法1.3.1 牛肉酶解物的制备图1 牛肉酶解物的制备流程Fig. 1 Flow chart for the preparation of beef

8、 hydrolysates牛肉酶解物的制备流程如图1所示。牛肉酶解物单因素试验用的是牛肉酶解物1（后臀肉），其他实验用的是牛肉酶解物2（背腰肉）。1.3.2 热反应牛肉香精的制备与单因素考察表 1 热反应牛肉香精中各种氨基酸源的单因素试验设计水平Table 1 Coded levels and corresponding actual values of independent variables used in one-factor-at-a-time design注：加粗数据为基础配方；括号内均为质量分数；体系总质量为35 g。因素水平123456氯化钠/g2.1002.1002.1002

9、.1002.1002.100牛油/g1.0001.0001.0001.0001.0001.000葡萄糖/g1.0501.0501.0501.0501.0501.050木糖/g0.1750.1750.1750.1750.1750.175复合料/g0.7000.7000.7000.7000.7000.700牛肉酶解物/g 0.000（0.00%）3.500（10.00%）10.500（30.00%）17.500（50.00%）19.250（55.00%）21.000（60.00%）HVP/g0.000（0.00%）0.700（2.00%）2.100（6.00%）3.500（10.00%）5.250

10、（15.00%）7.000（20.00%）酵母浸膏/g0.000（0.00%）0.350（1.00%）0.700（2.00%）2.100（6.00%）2.800（8.00%）3.500（10.00%）牛骨素/g0.000（0.00%）0.700（2.00%）2.100（6.00%）3.500（10.00%）5.250（15.00%）7.000（20.00%）半胱氨酸/g0.000（0.00%）0.035（0.10%）0.210（0.60%）0.420（1.20%）0.630（1.80%）0.840（2.40%）谷氨酸/g0.000（0.00%）0.035（0.10%）0.070（0.20%）0

11、.140（0.40%）0.210（0.60%）0.280（0.80%）VB1/g0.000（0.00%）0.035（0.10%）0.070（0.20%）0.140（0.40%）0.210（0.60%）0.280（0.80%）甘氨酸/g0.000（0.00%）0.035（0.10%）0.140（0.40%）0.280（0.80%）0.420（1.20%）0.525（1.50%）丙氨酸/g0.000（0.00%）0.035（0.10%）0.070（0.20%）0.140（0.40%）0.210（0.60%）0.280（0.80%）将反应原料加入厚壁耐压管，调节pH值至6.77.0，加入去离子水使得

12、体系总质量为35.000 g，110 条件下热反应1 h，冷却，待测定。固定热反应过程中的温度、时间、pH值以及氯化钠、牛油、葡萄糖、木糖、复合辛香料等原料的用量不变，通过单因素试验分别考察牛肉酶解物、HVP液、酵母浸膏、牛骨素、半胱氨酸、谷氨酸、VB1、甘氨酸、丙氨酸等各因素（不考察该因素时，设定值分别为10.500、2.100、0.700、2.100、0.210、0.070、0.035、0.140、0.070 g/35 g）对反应后体系中3-MCPD含量的影响，各因素的考察水平如表1所示，并通过SPSS 18.0对每个因素的影响进行单因素方差分析。1.3.3 氯丙醇的定性与定量氯丙醇的检测

13、采用GC-MS仪进行分析，参照GB/T 5009.1912006食品中氯丙醇含量的测定19中的方法对所制备的4 个样品和热反应原料以及4 种氯丙醇（2-MCPD、3-MCPD、1,3-DCP和2,3-DCP）标准液进行衍生处理，处理后的样品进GC-MS仪分析，选择离子监测，同时监测4 种氯丙醇的特征离子峰，3-MCPD的特征离子峰为m/z 253（定量离子）、275、289、291和453；2-MCPD的特征离子峰为m/z 253（定量离子）、289和291；1,3-DCP的特征离子峰为m/z 75、77、275（定量离子）、277（定量离子）；2,3-DCP的特征离子峰为m/z 253、75

14、（定量离子）、77（定量离子）、169。上述4 种氯丙醇标准液配制的质量浓度如表2所示，且均是用正己烷配制。表 2 氯丙醇标准液质量浓度梯度水平表Table 2 Concentration gradients of four chloropropanol standard solutions mg/L质量浓度水平氯丙醇2-MCPD3-MCPD1,3-DCP2,3-DCP 11.843 20.100 01.580 81.984 0 2 4.608 00.500 03.161 63.968 0 3 5.990 41.000 06.323 25.952 0GC-MS联机分析条件如下：GC条件：RTx

15、-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 µm）；进样口230 ，不分流进样，进样量1.0 µL；传输线250 ；载气He（99.999 5%），恒压模式41.4 kPa（6 psi）；升温程序：50 保持1 min，而后以2 /min速率升温至90 ，再以40 /min速率升温至250 ，保持5 min。MS条件：电子轰击源（electron impact ion source，EI），电压70 eV；离子源温度200 ；溶剂延迟12 min；选择离子模式（selective ion mode，SIM）扫描19。2 结果与分析2.1 热反应牛肉香精中

16、4 种氯丙醇的分析由图2可知，在根据基础配方随机制备的4 个热反应牛肉香精中均检出了3-MCPD，而其他3 种氯丙醇都未检测到，说明该方法制备的热反应肉味香精中3-MCPD的含量最大，故以此作为检测样品中氯丙醇的代表物。图2 3-MCPD在4 个样品及其标准品中的离子色谱图Fig. 2 Ion chromatogram of four samples containing 3-MCPD and 3-MCPD standard2.2 热反应原料中3-MCPD的分析由图3可知，反应原料中含有一定量的3-MCPD，其中复合香料中3-MCPD含量最高，为25.165 2 g/kg，其来源可能是在原料生

17、长过程中由环境污染引入，或保藏的过程中产生的；酵母浸膏、牛骨素、复合HVP液和牛肉酶解物中也都含有3-MCPD，其中牛肉酶解物2中含量最少，为2.499 9 g/kg。这4 种原料都含有脂肪和氯离子，其中的3-MCPD可能是制备的过程中生成的20-23。图3 原料中3-MCPD的含量Fig. 3 3-MCPD levels in various substrates2.3 单因素试验结果2.3.1 牛肉酶解物对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图4 牛肉酶解物对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 4 Effect of beef hydrolysates on 3-MCPD c

18、ontent of beef favorings图5 3-MCPD与氨基酸发生衍生化反应Fig. 5 Derivative reaction of 3-MCPD with amino acids由图4可知，在060%范围内，随着牛肉酶解物用量的增加，反应后热反应香精中3-MCPD的含量先增加后减少，然后再增加。牛肉酶解物中含有一定量的氨基酸24，当其添加量在030%之间时，体系中氨基酸源的比例在随着牛肉酶解物用量的增加而增加，此时热反应过程中3-MCPD的生成与衍生化反应速率基本处于平衡状态，反应后的3-MCPD主要由原料引入；其后，当牛肉酶解物用量继续增大时，此时牛肉酶解物中的氨基酸与3-M

19、CPD之间的衍生化反应占主要地位25（图5），3-MCPD含量逐渐降低；最后，随着牛肉酶解物用量的再次增加，牛肉酶解物中含的脂肪水解产生的甘油等产物与氯化物反应生成3-MCPD的过程又占主导位置26，故3-MCPD的含量又增加。因此，在实际热反应体系中，为降低3-MCPD的含量，可将牛肉酶解物用量控制在30%以内或30%55%范围内。2.3.2 HVP液对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图6 HVP液添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 6 Effect of HVP on 3-MCPD content of beef favorings由图6可知，HVP液的添加量在0

20、20%范围时，反应后体系中3-MCPD的含量先缓慢增大，然后减少，后又缓慢增加，其中当用量为15%时，反应后产物中3-MCPD含量最低。HVP液即水解植物蛋白液，其主要成分是氨基酸27，同时含有一定的氯离子、蛋白质、糖、油脂、3-MCPD等。HVP液的添加量在02%时，其含有的油脂水解产物丙三醇等会与氯离子进一步反应生成氯丙醇7，并且3-MCPD的生成反应占主导地位，故3-MCPD的含量缓慢增加；继续加大HVP液的添加量，此时体系中已生成的3-MCPD与HVP液中的氨基酸发生衍生化反应，且处于主导地位，故3-MCPD的含量在减少；当HVP液添加量在15%时，3-MCPD的生成与减少达到平衡，含

21、量达到最低。而随着HVP液添加量的继续加大，体系中3-MCPD的生成又占主导，故3-MCPD的含量又缓慢增加。因此，当HVP的添加量控制在10%15%之间时可减少体系中3-MCPD的含量。2.3.3 酵母浸膏对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响由图7可知，酵母浸膏的添加量在010%范围时，反应后体系中3-MCPD的含量随酵母浸膏添加量的增加，呈先增加后减少的趋势，在添加用量为2%时，3-MCPD的含量最大。酵母浸膏含有丰富的蛋白质、氨基酸和NaCl等28，当体系中酵母浸膏的添加量在02%之间，3-MCPD的生成占主导地位，故3-MCPD的含量增加；而当酵母浸膏的添加量逐渐加大时，体系中已生

22、成的3-MCPD与酵母浸膏中的氨基酸源发生衍生化反应的比例加大，故3-MCPD的含量又在减少。因此，实际热反应中，在不影响香精风味的条件下，宜尽量减少酵母浸膏的添加量（02%）。图7 酵母浸膏添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 7 Effect of yeast extract on 3-MCPD content of beef favorings2.3.4 牛骨素对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图8 牛骨素添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 8 Effect of prime bovine bone on 3-MCPD content of b

23、eef favorings由图8可知，牛骨素的添加量在020%范围时，反应后体系中3-MCPD的含量先缓慢增加后又缓慢减少，整体变化不大。牛骨素的主要成分为胶原蛋白29，胶原蛋白具有紧密的螺旋结构，水解后形成明胶，明胶在热水中会溶解形成网状分子，对3-MCPD的形成与衍生化反应没有大的影响，故3-MCPD的含量变化不大。牛骨素可保留原有动物天然的香气，且口感浓厚，具有良好的风味增强效果，赋予食品自然柔和的美味30，因此，在实际生产中的添加量（06%）可依据风味而定。2.3.5 半胱氨酸对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响由图9可知，半胱氨酸添加量在00.1%时，反应后体系中3-MCPD含量

24、呈明显减少趋势，在0.1%2.4%时，3-MCPD含量呈先缓慢增加，后减少的趋势。总体来看，反应体系中半胱氨酸的添加使得3-MCPD的含量是增大的，其对3-MCPD的影响机理还有待进一步研究。在实际生产中，可通过将半胱氨酸的添加量控制在0.1%左右来减少产品3-MCPD的含量。图9 半胱氨酸添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 9 Effect of cysteine on 3-MCPD content of beef favorings2.3.6 谷氨酸对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图10 谷氨酸添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 10 Eff

25、ect of glutamate on 3-MCPD content of beef favorings由图10可知，谷氨酸的添加量在00.8%时，反应后体系中3-MCPD的含量先减少然后缓慢增加，又缓慢减少。谷氨酸添加量在0.2%时，3-MCPD的含量最低。在实际生产中，控制谷氨酸的添加量在0.1%0.4%之间可减少3-MCPD的含量，且又不影响香精的风味。2.3.7 甘氨酸对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图11 甘氨酸添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 11 Effect of glycine on 3-MCPD content of beef favoring

26、s由图11可知，甘氨酸添加量在01.5%时，体系中3-MCPD的含量先增加然后减少后又增加。因此，实际热反应中，在不影响香精风味的条件下，宜适量（00.4%）使用甘氨酸。2.3.8 VB1对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图12 VB1添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 12 Effect of vitamin B1on 3-MCPD content of beef favorings由图12可知，VB1的添加量在00.4%时，反应后体系中3-MCPD的含量一直在增加。随着VB1添加量的增加，3-MCPD的含量在不断增加，这可能与VB1的结构有关。VB1是由嘧啶环和噻

27、唑环结合的双环化合物，易被氧化，受热时会生成具有肉香风味的含硫化合物31。实际热反应中，可在不影响风味的条件下通过尽量减少VB1的用量（00.2%）来减少3-MCPD含量。2.3.9 丙氨酸对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响图13 丙氨酸添加量对热反应牛肉香精中形成3-MCPD的影响Fig. 13 Effect of alanine on 3-MCPD content of beef favorings由图13可知，丙氨酸的添加量在00.8%之间时，反应后体系中3-MCPD的含量整体上变化不大，在00.2%之间，呈缓慢下降趋势，00.4%之间3-MCPD含量增加，在0.4%附近达到最大，

28、0.4%0.8%之间时又呈缓慢下降趋势。丙氨酸可增加调味品的调味效果、还可用作酸味矫正剂，改善有机酸的酸味，在食品工业中常用作防腐剂和调料32。实际热反应中，可在不影响风味的条件下通过控制丙氨酸的用量在0.2%左右来减少3-MCPD含量。通过单因素方差分析，以上9 个氨基酸源对3-MCPD的影响，结果显示每个因素在相应的变化范围内对3-MCPD含量都有显著性影响（P0.05）。3 结 论通过对牛肉香精反应原料中的分析，发现原料复合辛香料、酵母浸膏、牛骨素、HVP、11牛肉酶解物中均含有一定量的3-MCPD；通过单因素试验，考察牛肉酶解物、HVP、酵母浸膏、半胱氨酸、谷氨酸、VB1、牛骨素、甘氨

29、酸和丙氨酸对牛肉香精中3-MCPD生成量的影响，并进行了单因素方差分析，结果显示，这些氨基酸源的用量对牛肉香精中3-MCPD的生成量均有显著性影响。因此，为保证牛肉香精的安全，降低3-MCPD的含量，在牛肉香精的加工制作过程中，除对原料进行控制外，还应对氨基酸源的添加量加以优化和控制：可将牛肉酶解物用量控制在30%以内或30%55%；HVP的添加量控制为10%15%；谷氨酸的添加量为0.1%0.4%；半胱氨酸的添加量控制在0.1%左右；丙氨酸的用量在0.2%左右；同时，在不影响香精风味的条件下，宜尽量减少酵母浸膏（02%）和VB1（00.2%）的添加量，适量添加牛骨素（06%）和甘氨酸（00.

30、4%）。参考文献：1 孙宝国. 中国第三代肉味香精生产技术J. 中国食品学报, 2010, 10(5): 1-4. DOI:10.3969/j.issn.1009-7848.2010.05.001.2 李珺, 钟耀广, 刘长江. 肉味香精制备的研究进展J. 食品工业科技, 2010, 31(1): 429-431.3 孙宝国, 何坚. 香精概论M. 北京: 化学工业出版社, 2006: 344-350.4 陈锦屏, 张志国. 关于影响食品安全因素的探讨J. 食品科学, 2005, 26(8): 490-493. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2005.08.127.

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